[发明专利]一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法

权利要求书

1.一种基于冠心病心阳虚证的代谢标记物的鉴定方法，其特征在于，该方法具体是按照以下步骤进行的：

步骤一、利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物；

步骤二、利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构；

步骤三、鉴定冠心病心阳虚证受试者血液代谢生物标记物；

步骤三一、将内源性代谢物进行监督型OPLS-DA分析，分析得到正、负离子模式下的血液样本OPLS-DA模型二维得分Scores plot；根据得分Scores plot分析血液样本数据；

步骤三二、使用PCA，OPLS-DA获得潜在的生物标记物，根据分析的血液样本数据从OPLS-DA模型的S-plot列表中获得潜在生物标记物的各离子质量数；

步骤三三、根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物；

其中，所述38个生物标记物具体为尼古丁亚胺、25-羟基维生素D2-25-葡糖苷酸、全-反-七异戊烯-二磷酸、D-半乳糖、17a,21-二羟娠烯醇酮、溶血卵磷脂、油酸酰胺、乳糖神经酰胺、鞘磷脂、卵磷脂、亚油酸、尿酸、D-乳酸、胞嘧啶核苷、D-色氨酸、左旋谷酰胺、壬二酸、血管紧张素III、4-对羟基苯甲醛、4-对羟基苯甲酸、癸二酸、硫酸雄甾酮、脱氢异雄酮、N-[(3a,5b,7a)-3-羟基-24-氧化-7-(磺酰)cholan-24-yl]-甘氨酸、甘油鹅脱氧胆酸3-葡萄糖醛酸苷、孕二醇-3-葡萄糖醛酸苷、鹅去氧胆酸、3β,7α-二羟基-5-胆固酸酯、神经酰胺、11,12-环氧二十碳三烯酸、溶血卵磷脂、花生四烯酸、泛醌、非对称性二甲基精氨酸、尿苷/尿嘧啶核苷、吡咯烷酮羧酸、苯乙酰胺、a-N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺；

步骤一中利用UPLC-G2-Si-HDMS方法对n组健康受试者和n组冠心病心阳虚证受试者的血清样品进行UPLC分析确定血清样品中内源性代谢物具体过程为：

将n组健康受试者和冠心病心阳虚证受试者的血清样品中的每个样品取200μl合并，涡旋混匀，标记为血清QC样品，分装冻存；取室温解冻的血清QC样品200μl，加甲醇800μl，涡旋混匀30s，振荡15min，13000rpm在4℃离心15min，取上清液在45℃氮气流下吹干，残渣以200μl甲醇溶解，超声处理1min，涡旋混匀30s后，13000rpm在4℃离心15min，取上清液过0.22μm微型滤膜后，进样1μl供UPLC分析确定内源性代谢物；

所述UPLC分析色谱条件：色谱仪：WatersAcquityTM UPLC液相色谱仪；色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18 Column；流动相：流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水；柱温预设：50℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.5ml/min；进样量：1μl；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描分析；

梯度洗脱程序为：

步骤二中利用G2-Si-HDMS方法在正、负离子模式下对内源性代谢物进行全扫描得到质谱代谢轮廓图；根据质谱代谢轮廓图进行模式识别及统计分析，选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构具体过程为：

(1)、利用G2-Si-HDMS方法对内源性代谢物正、负离子模式全扫描，得到健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组个体血液样本的内含三维信息的质谱代谢轮廓图；

(2)、利用Markerlynx4.1软件获取血液样本代谢轮廓的质谱信息；其中，质谱信息包括保留时间、质核比和峰面积归一化值；

(3)、利用EZinfo软件将质谱信息进行非监督型PCA分析和监督型OPLS-DA分析，获得目标统计图或统计表；

(4)、采用SPSS17.0软件进行统计分析，将健康人受试者组和冠心病心阳虚证受试者组间数据比较采用T检验，寻找两组间的差异代谢物，进而选取保留时间和质核比一致的数据进行鉴定确定内源性代谢物结构；

所述质谱条件正离子扫描模式：脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；毛细管电压：3000V；扫描范围：m/z50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；工作站：MassLynx V4.1工作站；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统进行在线亮氨酸-脑啡肽质量校正；

所述质谱条件负离子扫描模式具体为：毛细管电压：2500V；脱溶剂气流量：1000L/h；脱溶剂气温度：350℃；锥孔反吹气流量：50L/h；离子源温度：110℃；锥孔电压：20V；扫描范围：m/z 50-1200Da，以centriod模式进行数据采集；锁定质量溶液：采用Lockspray校正系统进行在线亮氨酸-脑啡肽质量校正；

步骤三三中根据内源性代谢物结构获得的内源性代谢物结构分子式以及潜在的生物标记物离子获得的二级质谱信息进行独立样本t检验鉴别了38个生物标记物具体过程为：

1)根据内源性代谢物结构确定在质量碎片下在5ppm内获得内源性代谢物结构分子式；

2)对潜在的生物标记物离子进行二级数据扫描，获得二级质谱信息；

3)通过内源性代谢物结构分子式、二级质谱信息及二级质谱信息中的潜在的生物标记物离子裂解方式进行匹配，鉴定或表征得到各潜在生物标记物；

4)将所有鉴定或表征后的各潜在生物标记物均进行独立样本t检验，鉴别了38个生物标记物。