[发明专利]细菌基因编辑方法

说明书

本发明公开一种细菌基因编辑方法，其步骤包括：提供一菌体；将一pCas9质粒和一pKD46质粒送入菌体中；将一pCRISPR::LacZ质粒和一外源DNA共同送入含有pCas9及pKD46质粒的菌体中，以得到一培养菌液；以及将培养菌液涂布在一培养基上进行培养。借此，能增加细菌的基因编辑的速度，并提升细菌进行基因重组的成功率。

技术领域

本发明涉及一种细菌基因编辑方法，特别是涉及一种利用CRISPR/Cas9技术来增加大肠杆菌和蓝绿菌的基因编辑效率以及基因重组成功率的细菌基因编辑方法。

背景技术

利用传统的基因编辑技术来改造细菌以进行代谢工程时，需把所述细菌DNA的某些基因剔除或是同时放入好几个基因，若将这些基因一次放入，片段会很大，因此须分好几次把这些基因放进去，于过程中会加入抗生素、再筛选、接着把抗生素移除，重复这些步骤直到基因放入完全为止，其步骤繁杂又耗时。

CRISPR/Cas9为近年来备受瞩目的基因编辑技术，相较于传统基因编辑技术，CRISPR/Cas9因可以同时剔除或放入多个基因，增加了基因编辑的便利性，技术也相对简单。然而，在过去的研究中，CRISPR/Cas9多用在哺乳动物的基因编辑，显少应用在细菌中，即使有应用在细菌的研究结果，可以放入的DNA片段也较小，到3kb以上就有效率降低的现象。

因此，如何利用CRISPR/Cas9来提升在细菌中的基因编辑效率，以克服上述的缺失，已成为本领域所欲解决的重要课题之一。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种细菌基因编辑方法，用以将大片段的DNA放入菌体中，以增加细菌的基因编辑的速度，并提升细菌进行基因重组的成功率。

为了解决上述的技术问题，本发明所采用的一种技术方案是，提供一种细菌基因编辑方法，其步骤包括：提供一菌体；将一pCas9质粒和一pKD46质粒送入菌体中；将一pCRISPR::LacZ质粒和一外源DNA共同送入含有pCas9及pKD46质粒的菌体中，以得到一培养菌液；以及将培养菌液涂布在一培养基上进行培养。

优选地，将所述pCRISPR::LacZ质粒和所述外源DNA共同送入含有所述pCas9及pKD46质粒的所述菌体中的步骤后，还包括：利用Cas9蛋白及可辨视LacZ基因的向导RNA在所述菌体中的一LacZ基因位置进行专一性地切割；以及将所述外源DNA插入所述菌体内具有专一性切割位置的所述LacZ基因中，以得到所述培养菌液。

优选地，所述菌体为大肠杆菌。

优选地，所述大肠杆菌为MG1655菌株。

优选地，所述pCRISPR::LacZ质粒为一可辨视LacZ基因的向导RNA。

优选地，将所述pCas9质粒和所述pKD46质粒送入所述菌体的方法为电穿孔转型法。

优选地，将所述pCRISPR::LacZ质粒和所述外源DNA共同送入含有所述pCas9质粒及所述pKD46质粒的所述菌体中的方法为电穿孔转型法。

优选地，所述培养基含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、卡那霉素、以及四环霉素。

优选地，所述培养菌液的培养条件为，以37℃培养16至24小时。

为了解决上述的技术问题，本发明所采用的另一种技术方案是，提供一种提供一菌体；将一pHR_trc模板质粒和一pCas9-NSI质粒共同送入所述菌体中，以得到一培养菌液；以及将所述培养菌液涂布在一培养基上进行培养。

优选地，所述菌体为蓝绿菌。

优选地，所述蓝绿菌为细长聚球藻的S.elongatus PCC 7942菌株。