[发明专利]一种单环刺螠精子冷冻保存液及其制备方法

说明书

本发明涉及一种包括单环刺螠精子、保存剂与抗冻剂的单环刺螠精子冷冻保存液，其制备方法包括取材，精子活力鉴定，精子稀释，降温平衡，第一次预冷，第二次预冷，保存，解冻和洗脱等步骤；本发明可以长期有效地保存单环刺螠精子，利用本发明将单环刺螠精子在液氮中保存，解冻后的精子激活率可达70％以上。本方法无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，效果好，为单环刺螠的人工授精工作提供了精子来源保障，并可用于单环刺螠的杂交育种、种质优选、雌核发育及物种保护等其他研究领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单环刺螠精子冷冻保存液及其制备方法。

背景技术

在水产增养殖生产中，随着人工授精技术的发展和种质资源保护的需要,水产经济动物的精子体外保存技术研究日益受到关注。精子的体外保存可解决雌、雄成熟不同步问题，同时也降低了饲养大量亲本所需的花费,对人工繁育、种质优选及精子代谢和生理等研究提供了技术平台。单环刺螠肉味鲜美、营养丰富、价格适中，被称为“裸体海参”，市场需求量不断增加。近年来还发现单环刺螠体内存在多种生物活性肽，具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节等功能。单环刺螠对海水中有害物质硫化物有较强的耐受与解毒能力，可对调节水质、缓解海洋污染起到一定积极的作用。由于过度捕捞导致单环刺螠的天然资源量锐减，已远远不能满足人类的需求，因此亟待开展单环刺螠的人工增养殖。在单环刺螠人工繁殖生产中，如何同时获取高质量的成熟精卵是一个主要问题。

原有专利技术已涉及到鱼类(太平洋鳕鱼、云斑尖塘鳢、棘头梅童鱼、斑点叉尾鮰、小黄鱼、黄鳝等)和少数贝类(魁蚶、香港牡蛎等)，迄今尚无关于单环刺螠精子保存技术的专利。单环刺螠(Urechis unicinctus)隶属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科，俗称海肠。由于不同种类动物的精子具有不同的生物学特性，所以原有技术不适宜用于单环刺螠精子的保存。

发明内容

为克服上述问题，本发明的目的在于提供一种单环刺螠精子冷冻保存液。

本发明的技术方案是通过下列方式实现的：

一种单环刺螠精子冷冻保存液，包括单环刺螠精子、保存剂与抗冻剂。

优选的，所述保存液pH为4-11，更优选6-9，进一步优选8-9，特别优选8。

优选的，所述保存液的盐度为10-40，更优选20-35，进一步优选25-35，特别优选25-30。

优选的，所述保存剂包括中性盐与弱碱性盐。更优选的，所述中性盐选自钠盐、钾盐、钙盐或镁盐中的一种或多种。进一步的，所述中性盐选自NaCl，KCl，CaCl₂，MgCl₂，Na₂SO₄，K₂SO₄，MgCl₂.6H₂O，MgCl₂或NaH₂PO₄中的一种或多种，优选NaCl，KCl和CaCl₂中的一种或多种，更优选的，所述中性盐为NaCl，KCl和CaCl₂的混合物，进一步优选的，所述混合物中NaCl，KCl和CaCl₂的质量比为2500：20：21。

优选的，所述弱碱性盐选自NaHCO₃，或KHCO₃，更优选的，所述中性盐为NaCl，KCl和CaCl₂的混合物，所述CaCl₂与NaHCO₃的质量比为10:1。

优选的，所述抗冻剂选自二甲基亚砜和/或甘油，更优选10％-15％V/V二甲基亚砜或5％-10％V/V甘油，进一步优选10％V/V二甲基亚砜或5％V/V甘油。

优选的，所述保存液进一步被冻干。