[发明专利]一种单环刺螠精子冷冻保存液及其制备方法

权利要求书

1.一种单环刺螠精子冷冻保存液，包括单环刺螠精子、保存剂与抗冻剂，所述保存液pH为8，所述保存液的盐度为25-30，所述保存剂包括中性盐与弱碱性盐，所述中性盐为NaCl，KCl和CaCl₂的混合物，所述弱碱性盐选自NaHCO₃；所述混合物中NaCl，KCl和CaCl₂的质量比为2500：20：21；所述CaCl₂与NaHCO₃的质量比为10:1。

2.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于，所述抗冻剂选自二甲基亚砜和/或甘油。

3.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于，所述抗冻剂为10％-15％V/V二甲基亚砜或5％-10％V/V甘油。

4.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于，所述抗冻剂为10％V/V二甲基亚砜或5％V/V甘油。

5.根据权利要求1所述的冷冻保存液，其特征在于，所述保存液进一步被冻干。

6.权利要求1-5任意一项所述冷冻保存液的使用方法，包括取材，精子活力鉴定，精子稀释，降温平衡，第一次预冷，第二次预冷，保存，解冻和洗脱步骤。

7.根据权利要求6所述的使用方法，包括如下步骤：

(1)取材：取单环刺螠成熟雄体，75％乙醇擦拭肾孔周围体表，从肾孔吸取精液，置于广口瓶中；

(2)精子活力鉴定：显微镜观察，镜检单环刺螠精子激活率达到85％以上；

(3)精子稀释：加入精子保存剂，稀释成精子悬浮液；

(4)降温平衡：于稀释后精液中添加抗冻剂，震荡混匀，分装至冻存管中，于冷藏箱中降温平衡；

(5)第一次预冷：在保温瓶中放入支架，加入液氮，在装有精子的冻存管平铺于保温瓶中的平筛网表面，盖上保温瓶盖；

(6)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮面接近平筛网面，盖上保温瓶盖；

(7)保存：取出冻存管，迅速将其放入液氮罐中保存。

8.根据权利要求6所述的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：

(1)取材：取单环刺螠成熟雄体，75％乙醇擦拭肾孔周围体表，用吸管从肾孔吸取精液，置于灭菌干燥后的广口瓶中；

(2)精子活力鉴定：用吸管取1滴精液于载玻片上，加上1滴海水制成涂片，显微镜观察，镜检单环刺螠精子激活率达到85％以上，用于冷冻保存；

(3)精子稀释：加入相对于精液体积的20倍精子保存剂，稀释至10⁶个/mL的精子悬浮液；

(4)降温平衡：于稀释后精液中添加抗冻剂，震荡混匀，分装至1.8mL冻存管中，于4℃冷藏箱中降温平衡30min；

(5)第一次预冷：在保温瓶中放入支架，加入液氮，使液氮面距离平筛网面5cm；在装有精子的冻存管外系上1m长线绳，将冻存管平铺于保温瓶中的平筛网表面，盖上保温瓶盖；

(6)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮面接近平筛网面，盖上保温瓶盖；

(7)保存：取出冻存管，迅速将其放入液氮罐中保存；

(8)解冻和洗脱：当需要使用所保存的精子标本时，打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的线绳，将冻存管拎出，迅速放入水浴中解冻后，加入精子保存剂，震荡混匀，1000r/min离心5min，取得白色精子沉淀镜检后用于人工授精。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)中单环刺螠置于4℃的广口瓶中备用。

10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)中精子保存剂包括NaCl25.00g，KCl 0.20g，CaCl₂0.21 g，NaHCO₃0.021 g，将上述保存剂溶于1L蒸馏水中。