[发明专利]一种EV71-VP1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种EV71‑VP1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用。分离人手足口病病毒，全基因组测序得到EV71病毒VP1结构蛋白，将其分成20组并合成多肽片段。筛选出含EV71病毒抗体血清，通过酶联免疫吸附反应初步筛选出具有较高免疫效果的2号、4号和8号多肽。为进一步验证上述初步筛选的多肽是否在小鼠模型内具有免疫效果，本发明合理设计了Balb/c小鼠试验模型，并对其进行病理切片HE染色病理分析，8号多肽对模型Balb/c小鼠的小肠、骨骼肌和大脑均具有较高的免疫效果，2号多肽对模型Balb/c小鼠的骨骼肌具有较高的免疫效果。通过上述酶联免疫吸附实验及模型Balb/c小鼠的病理检查综合分析和验证，结果表明本发明优选的2号多肽和8号多肽在EV71病毒疫苗开发应用中潜力巨大。

技术领域

本发明属于免疫生物医学领域，具体涉及一种EV71-VP1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

肠道病毒71型（EV71）是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一，目前，尚无针对EV71的抗病毒药物，主要是对症治疗。在抗病毒药物的研究方面，体外实验证明吡啶基咪唑啉二酮衍生物可有效的抑制EV71的复制，是目前较为有前景的候选药物。EV71病毒的全病毒灭活疫苗以全病毒作为抗原，但从安全角度考虑，尤其是在免疫力较差的个体中，可能产生对人体有害作用，因此，近年来亚单位疫苗成为研究的焦点。

多肽疫苗是用化学合成法或基因工程手段合成病原微生物的保护性多肽或表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。相对于常规疫苗和基因重组疫苗，多肽/表位疫苗不含有对动物构成潜在威胁的病毒基因组信息，不存在发生病毒基因与宿主细胞基因的整合或重组，不会对动物或人类构成潜在的威胁，是一种安全的疫苗。大量的研究表明，EV71受感人群及动物免疫实验产生的中和抗体具有抗EV71病毒作用，且能够形成一定的保护效果，体外实验证实产生的中和抗体具有病毒中和活性。目前在研究的EV71疫苗大多是病毒灭活疫苗，刚进入I期临床试验阶段。亚单位疫苗在安全性上明显优于传统疫苗，寻找有效的抗原蛋白是基因工程重组疫苗成功的关键。VP1是研究最多的衣壳蛋白，被认为是EV71中和抗原决定簇最为集中的区域。

本发明将人手足口病病毒分离，全基因组测序分析，得到的EV71病毒VP1结构蛋白，将其氨基酸分成20组，每组15个氨基酸加上上游的5个氨基酸，每组为20个氨基酸的多肽，最后一组为12个氨基酸，通过化学合成这些多肽片段。收集病愈2-3个月的健康患儿的血清。将合成的多肽片段包被固相载体ELISA96孔板，加入患儿血清孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，底物显色测定吸光度，筛选能与血清免疫结合的多肽片段。然后将筛选的多肽通过动物体内免疫及相关病理检查深入研究多肽抗原的特性。为进一步深入了解EV71四种衣壳蛋白的相关性质，为今后的多肽疫苗候选抗原的筛选提供了重要依据。

发明内容

本发明目的是提供一种EV71-VP1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用。

本发明涉及一种多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1-20中任一序列所示：

为达到本发明目的，其技术方案主要涉及如下：

首先，将人手足口病病毒分离，并对其进行全基因组测序分析，得到的EV71病毒VP1结构蛋白。将以上分离得到的VP1结构蛋白的氨基酸序列分成20组，每组15个氨基酸，加上上游的5个氨基酸，每组为20个氨基酸的多肽，最后一组为12个氨基酸，通过化学合成这些多肽片段（由吉尔生化有限公司合成），具体多肽序列见序列表中SEQ ID NO.1-20中任一序列所示。

作为优选的，收集病愈2-3个月的健康患儿的血清。

作为优选的，将合成的多肽片段包被固相载体ELISA96孔板（购于上海联科生物科技有限公司），加入患儿血清孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗IgG（兔抗人，购于青岛捷世康生物科技有限公司）孵育，底物显色测定吸光度，筛选出能与血清免疫结合的多肽片段。