[发明专利]一种基于SPR技术的吗啡检测方法

说明书

技术领域

本发明属于毒品检测领域，涉及一种基于SPR技术的吗啡检测方法。

背景技术

吗啡由鸦片提纯而成,白色结晶,在鸦片中含量10％左右,为无色或白色结晶粉末状,具有镇痛、催眠、止咳、止泻、抑制呼吸及肠蠕动作用,主要用于缓解急性锐痛及心源性哮喘。吸食后会产生欣快感,比鸦片容易成瘾。长期使用会引起精神失常、谵妄和幻想,过量使用会导致呼吸衰竭而死亡。历史上它曾被用做精神药品戒断鸦片,但由于其副作用过大,最终被定为毒品。

尽管已有化学法、色谱法、光谱法、免疫法、毛细管电泳法和离子迁移谱法等方法应用到毒品检测中，但化学法灵敏度低，色谱法、毛细管电泳法和离子迁移谱法前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器，光谱法灵敏度低以及对待测样品纯度要求较高，免疫法操作时间过长。目前应用于吸毒检测中最广泛的为胶体金试纸，但其以吸毒人员尿液为检测对象，且其灵敏度只有300-1000ng/ml。而本技术以其高灵敏度，可实现对吸毒人员的唾液中毒品进行检测，从而避免了对客体隐私的侵犯，并大大提高了工作效率。

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术是基于物理光学现象的一种分析技术。当偏振光以共振角入射照在金属和电介质的界面上时，发生全反射，入射光的一部分能量与表面等离子体波发生耦合，引起表面等离子体共振，产生光强急剧减少的反射光。利用光学SPR技术测定时，一般是将一种功能反应物(如配体)固定在传感芯片表面金属膜上，当加入待测样品(受体)并使其与传感芯片上的功能反应物相互作用时，引起体系的折射率变化，从而引起SPR光学信号的改变。由于SPR技术的高识别性、高灵敏性、快速、原位(无需标记)、便捷、实时等优点，SPR传感技术现已被广泛应用于生命科学研究、药物筛选、食品分析、环境监测、农业生产等领域。

目前，国内外未见将吗啡检测与SPR技术结合在一起的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对目前胶体金试纸较低的检测灵敏度，提供一种基于SPR的实时、快速、高灵敏度的吗啡检测技术，所述方法检测灵敏度高，大大降低吸毒人员检测的漏检率，具有重要的应用价值。

本发明基于SPR技术的吗啡检测的方法，是将SPR芯片经EDC/NHS活化后的羧基基团偶联BSA上的氨基后作为传感芯片，当待测样品通过传感芯片表面时，利用表面等离子体共振检测仪检测待检测唾液与分子识别敏感芯片界面处全反射光的光强变化来直接测定唾液中的吗啡含量,具体包括如下步骤：

步骤(1)：将SPR芯片放置到SPR仪器中作为传感芯片，仪器温度设定为20～30℃；

所述的SPR芯片是先在玻璃基底上表面镀一层2～3nm厚的铬层，再在铬层上表面镀一层40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巯基烷醇后用环氧氯丙烷处理生成环氧基，环氧基共价结合葡聚糖后用溴乙酸处理使葡聚糖羧基化，从而得到羧基化的葡聚糖表面；该SPR芯片经EDC/NHS活化后的羧基基团可以偶联BSA上的氨基；

步骤(2)：以10～30μL/min的流速往SPR芯片表面通入200～300μL EDC/NHS混合液，活化该芯片表面的羧基基团；

所述的EDC/NHS混合液为EDC与NHS的等体积混合溶液；其中EDC为N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亚胺，浓度为0.2～0.4M；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，浓度为0.1～0.2M；

步骤(3)：在步骤(2)活化表面羧基后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入0.5～2mg/mL BSA-Morphine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(RU)达到2000～3000；

所述的BSA-Morphine为人工合成的吗啡完全抗原，即在BSA(牛血清白蛋白)表面偶联了Morphine(吗啡)分子，可购买获得；pH值为4.5～5.5；

步骤(4)：在步骤(3)BSA-Morphine偶联后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入75～100μL乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；

所述的乙醇胺盐酸盐溶液的浓度为1～2M；

步骤(5)：在步骤(4)处理后SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入30～50μL梯度浓度的吗啡抗体，确定合适的抗体浓度；

所述的吗啡抗体为对BSA-Morphine具有特异性识别的鼠源单克隆抗体。