[发明专利]一种抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白及应用

权利要求书

1.一种抗IL-4R单链抗体与蛇毒L-氨基酸氧化酶融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白制备方法：通过重叠延伸PCR技术方法将抗IL-4R单链抗体与竹叶青蛇毒LAAO基因连接成scFv-LAAO融合基因，所述scFv-LAAO融合基因序列如SEQ ID No.3所示，构建重组质粒pET28a-scFv-LAAO，转入BL21(DE3)原核表达菌，诱导表达scFv-LAAO融合蛋白，即得；所述融合蛋白的制备具体包括以下步骤：

(1)选择酶切位点为EcoRⅠ和XhoⅠ的scFv基因序列，将scFv与LAAO两段基因通过重叠延伸PCR技术进行连接，连接前将scFv基因序列的XhoⅠ酶切位点去掉，并在LAAO基因的3’端加上XhoⅠ酶切位点，在竹叶青蛇毒LAAO基因序列5’端加上带有一段与抗IL-4R单链抗体scFv基因序列相同的重叠序列，以及一段连接肽连接基因，另外在“重叠序列”基因序列的3’端加上XhoⅠ酶切位点；

其中，设计引物F1和引物F2去除抗IL-4R单链抗体scFv基因序列的Xho I酶切位点；

(2)设计引物F1和F3，通过SOE-PCR技术连接抗IL-4R单链抗体scFv基因与竹叶青蛇毒LAAO基因，得融合基因scFv-LAAO；

(3)pET-28a载体/scFv-LAAO基因片段的双酶切与目的片段回收：设计反应体系：scFv-LAAO基因片段5-15μL，XhoⅠ、EcoRⅠ各1-3μL，10×Buffer Tango2-3μL，ddH₂O 30-40μL；以上成分加入PCR管中，于35-40℃酶切3-5h，78-82℃下灭活XhoⅠ酶18-22min后；冷却至10-14℃，再加入1.5-2.5μLEcoRⅠ内切酶，35-40℃酶切3-5h，60-70℃，灭活18-22min；取scFv-LAAO基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段；按照同样方法对pET-28a载体进行双酶切和回收目的片段；

(4)重组质粒pET-28a-scFv-LAAO的构建与转化：取经过XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切的pET-28a载体目的片段5-15μL、scFv-LAAO双酶切目的片段35-45μL、Rapid T4 DNA ligase 1-3μL、快速连接缓冲液5-25μL、ddH₂O 15-20μL，14-18℃过夜；将构建的pET-28a-scFv-LAAO重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，复苏后进行培养；所述连接快速缓冲液含Tris-HCl 0.1mol/L、MgCl₂20mmol/L、二硫苏糖醇DTT 20mmol/L、三磷酸腺苷ATP 0.4mmol/L、盐酸亚精胺1mmol/L和牛血清白蛋白BSA0.1mg/mL；

(5)重组质粒酶切鉴定和蛋白质分子量大小预测：取10个单菌落接种于15mL含卡那霉素50μg/mL的TB培养液的100mL培养瓶中，于36-38℃环境下震荡培养至0D₆₀₀＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒；依次用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对该质粒进行双酶切鉴定；将成功酶切的质粒进行测序，并对测序结果进行蛋白质氨基酸序列翻译，并对翻译结果进行预测分析；

(6)重组毒素scFv-LAAO抗体蛋白的诱导表达：取平板上的单个菌落接种至装有8-12mL的含卡那霉素45-55μg/mL的TB培养基的50mL锥形瓶中，于35-40℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.4；取菌液3500-4500rpm离心10-20min，重复三次，转移菌液至装有100mL含卡那霉素50μg/mL的TB培养基的500mL锥形瓶中，于35-40℃下振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入浓度为0.5-1.5mM的IPTG，于35-40℃振荡培养诱导重组蛋白表达2-4h，即得；

所述scFv基因序列为：

GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCTGCAG.CAGTCCGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCCTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCCACCAATGGTGGTTCTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACATCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGTCCCTGGGATGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCGGCCGCAGAATGACTCGAG；所述引物F1为：5’-GAATTCATGGCCCAGGTCCAGCT-3’；

所述引物F2为：5’-GCTGAAACGGGCGGCCGCAGAA-3’；

所述引物F3为：5’-ATGACGATGAACTTTAACTCGAG-3’。