[发明专利]一种水牛角的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水牛角的检测方法。

背景技术

水牛角具有清热、凉血、定惊、解毒之功效，可以治疗伤寒、温疫、热入血分、惊狂、烦躁、谵妄、斑疹、发黄、吐血、衄血、下血、痈疽肿毒。但是现行检测水牛角的方法存在缺陷：对水牛角的性状进行观察的方法，该方法准确度非常低。

发明内容

本发明为了克服现有水牛角检测方法的缺点，提供了一种准确度高、可行性好、重现性好的水牛角的检测方法。

本发明的第一个方面是提供一种水牛角的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)进行水牛角检测的步骤，其中，以水牛角对照药材为对照品，以m/z459.7±0.5(双电荷)→391.9±0.5(单电荷)和m/z459.7±0.5(双电荷)→505.1±0.5(单电荷)作为检测离子对。

优选地，上述检测方法中，所述高效液相色谱的条件为：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶，流动相A选自甲酸、乙酸、甲酸水溶液或乙酸水溶液中的至少一种，优选自0.1％(v/v)甲酸的水溶液或0.1％(v/v)乙酸的水溶液；流动相B选自乙腈、甲醇或甲酸的乙腈溶液中的至少一种，优选为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，进行梯度洗脱。

更优选地，所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.1％(v/v)甲酸的水溶液为流动相A，以0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱：0～25分钟，A 95％→80％，B 5％→20％；25～40分钟，A 80％→50％，B 20％→50％；40～41分钟，A 50％→1％，B 50％→99％；41～45分钟，A 1％→1％，B 99％→99％。

优选地，上述检测方法中，所述质谱采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI⁺)，进行多反应监测。

优选地，上述检测方法包括将所述水牛角进行酶解的步骤。

更优选地，所述酶解包括向水牛角中依次加入尿素，二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAA)和酶的步骤。

更进一步优选地，所述酶解包括如下步骤：向水牛角中加入尿素，再加入DTT，60±5℃加热30±5min，冷却，加入IAA，黑暗中放置30±5min，加碱稀释至10ml，加酶于37℃反应12h以上。

优选地，上述检测方法中，所述酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的至少一种，优选胰蛋白酶。

优选地，上述检测方法中，所述碱为碳酸氢铵(NH₄HCO₃)。

优选地，上述检测方法包括如下步骤：

(1)将水牛角按所述的酶解的步骤制得供试品溶液；

(2)取水牛角对照药材按所述的酶解的步骤制得对照品溶液；

(3)分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪测定，以m/z459.7±0.5(双电荷)→391.9±0.5(单电荷)和m/z459.7±0.5(双电荷)→505.1±0.5(单电荷)作为检测离子对。

更优选地，上述检测方法包括如下步骤：

(1)将水牛角粉碎，取水牛角粉末10mg，加8M尿素1ml，加入1M的DTT 10μl，60℃加热30min，冷却，加入1M的IAA 30μl，黑暗静置30min，加入浓度为0.01g/ml的NH₄HCO₃溶液稀释至10ml，加入由浓度为0.01g/ml的NH₄HCO₃溶液配制的浓度为1μg/μl的胰蛋白酶溶液20μl，37℃反应12h以上，得酶解溶液，取适量酶解溶液过0.22μm的滤膜，续滤液置进样瓶中，制得供试品溶液；

(2)取水牛角对照药材，按步骤(1)的方法制得对照品溶液；