[发明专利]MDCK细胞无血清悬浮培养技术生产H9亚型流感疫苗

说明书

本发明公开了一种MDCK细胞无血清悬浮培养技术生产H9亚型流感疫苗，所述培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物和活性添加剂；所述生产H9亚型流感疫苗的方法包括步骤：(1)悬浮细胞的复苏；(2)细胞传代培养及种子细胞扩增；(3)细胞反应器培养；(4)接种H9亚型流感病毒种毒液及毒液收获。本发明的方法工艺过程简化、规模放大、产量增加、无需消化、洗涤和离心换液步骤，效益显著。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，涉及采用MDCK细胞无血清单细胞悬浮培养技术生产H9亚型流感疫苗。

背景技术

近年来，动物细胞培养技术发展迅速并越来越多用于生产流感疫苗，以逐步取代传统的鸡胚培养法。

现有技术中，流感疫苗生产工艺中所选取的细胞通常为贴壁细胞，以单层贴附方式生长，因此大多需采用有血清微载体的培养工艺。但是，血清存在价格昂贵、批次间差异大、存在外源病原体污染等缺点。并且，血清中含有大量未知蛋白组分，使得下游产品分离纯化困难。因此，需开发无血清培养基用于高效生产流感疫苗。但目前在大多数无血清生产工艺中，细胞仍以贴壁方式生长，细胞传代和种子细胞扩增过程中需要洗涤、离心，大规模批次培养细胞扩增流感病毒时需要微载体提供贴附基质，不仅增加了生产成本，而且操作异常复杂，费时费力，不利于扩大生产规模。

目前，MDCK、PER.C6、AGE.CR、EB14/EB66、CAP等多种悬浮细胞已经应用于流感疫苗生产工艺中，尤其是MDCK悬浮细胞应用最为广泛。但是，通常的批式培养方式中病毒扩增效率很低，只有通过复杂的流加和灌注培养模式才能得到足够高的病毒滴度。然而流感病毒是裂解性病毒且扩增迅速，会快速杀死宿主细胞，故而复杂耗时的流加和灌注培养模式往往虽能获得高病毒滴度，却浪费了大量培养基。

综上所述，本领域迫切需要研发出简单高效的无血清单细胞悬浮的培养方式，无需使用微载体，能够批次生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无血清培养基，以及利用MDCK细胞无血清悬浮培养技术生产H9亚型流感疫苗的方法。

本发明第一方面，提供一种适于MDCK细胞悬浮培养的无血清培养基，所述培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物和活性添加剂；其中，

所述氨基酸包括选自下组的16-19种氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；

所述维生素选自下组：生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸、或其组合；

所述脂类选自下组：胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80、嵌段式聚醚F68、或其组合；

所述微量元素选自下组：硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、亚硒酸钠、或其组合；

所述蛋白水解物为胰蛋白水解物；

所述活性添加剂选自下组：葡萄糖、胰岛素、大豆水解物、次黄嘌呤、胸苷、柠檬酸铁铵、白蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述葡萄糖的含量范围为6000-8500mg/L培养基(较佳地为7000-8000mg/L培养基)，以培养基体积计。

在另一优选例中，所述胰岛素的含量范围为1-5mg/L培养基(较佳地为3-4.6mg/L培养基)，以培养基体积计。

在另一优选例中，所述大豆水解物的含量范围为1000-3000mg/L培养基(较佳地为2000-2800mg/L培养基)，以培养基体积计。

在另一优选例中，所述柠檬酸铁铵的含量范围为5-45mg/L培养基(较佳地为25-40mg/L培养基)，以培养基体积计。