[发明专利]MDCK细胞无血清悬浮培养技术生产H9亚型流感疫苗

权利要求书

1.一种适于MDCK细胞悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物和活性添加剂；其中，

所述氨基酸包括：丙氨酸22.3 mg/L、精氨酸273 mg/L、天冬酰胺33 mg/L、天冬氨酸33.3 mg/L、胱氨酸42 mg/L、半胱氨酸68.0 mg/L、谷氨酸36.8 mg/L、谷氨酰胺876 mg/L、甘氨酸25 mg/L、组氨酸73 mg/L、异亮氨酸90 mg/L、亮氨酸161 mg/L、赖氨酸107.3 mg/L、甲硫氨酸89 mg/L、苯丙氨酸100.2 mg/L、脯氨酸95 mg/L、丝氨酸78 mg/L、苏氨酸136 mg/L、色氨酸57 mg/L、酪氨酸58 mg/L和缬氨酸99 mg/L；

所述维生素为生物素0.072-0.1mg/L、叶酸2-5mg/L、烟酰胺2-10mg/L、吡哆醇1-5mg/L和硫胺素1-5mg/L，以培养基体积计；

所述脂类为：胆固醇1-5 mg/L、生育酚醋酸酯1.39 mg/L、豆蔻酸0.2284 mg/L和棕榈酸0.256 mg/L；

所述微量元素为：硫酸铜5-20mg/L、硝酸铁20-100mg/L、硫酸亚铁0.1-0.6mg/L和亚硒酸钠50-150mg/L，以培养基体积计；

所述蛋白水解物为胰蛋白水解物，且所述胰蛋白水解物的含量为1500-3000mg/L，以培养基体积计；

所述活性添加剂为：葡萄糖、胰岛素、大豆水解物、次黄嘌呤、胸苷和柠檬酸铁铵；

其中，所述葡萄糖的含量范围为7000-8000mg/L培养基，所述胰岛素的含量范围为5.34mg/L培养基，所述大豆水解物的含量范围为2000-2800 mg/L培养基，所述次黄嘌呤的含量范围为3-11mg/L培养基，所述胸苷的含量范围为0.15-0.5mg/L培养基，所述柠檬酸铁铵的含量范围为25-40mg/L培养基，以培养基体积计。

2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述的培养基为液态，或重构为液态时，pH为6.0-8.0。

3.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述盐类为：氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和丙酮酸钠；

并且，所述盐类的含量为：氯化镁2856mg/L、硫酸镁20-100mg/L、氯化钙150-200mg/L、氯化钾300-500mg/L、氯化钠1000-7000mg/L、磷酸氢二钠50-100mg/L、磷酸二氢钠50-100mg/L。

4.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述缓冲剂为碳酸氢钠。

5.一种使用如权利要求1所述的MDCK培养基生产H9亚型流感疫苗的方法，包括步骤：

(1) 提供一如权利要求1所述的无血清培养基；

(2) 悬浮MDCK细胞的复苏；

(3) 悬浮细胞传代培养：取MDCK细胞悬浮液，传代培养，接种密度范围为1×10⁵细胞/毫升-1×10⁷细胞/毫升；

(4) 悬浮细胞反应器培养：将步骤(3)中的MDCK细胞悬浮液加入反应器中培养；

(5) 接种H9亚型流感病毒及毒液收获：以病毒感染复数0.01-1的范围内取种毒液接种至反应器中，获得所述H9亚型流感病毒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述获得的H9亚型流感病毒HA滴度范围为2^11.5血凝单位/50微升-2¹²血凝单位/50微升。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)-步骤(5)中，均不需要进行离心换液操作，和/或，所述MDCK细胞是全悬浮非贴壁的。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述反应器中的搅拌转速为100-200转/分。