[发明专利]重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP及诊断试剂盒

说明书

本发明公开了一种重组单纯疱疹病毒HSV‑hTERTp_ICP4_LungCA‑GFP及其对应的诊断试剂盒，所述病毒的基因组上的端粒酶逆转录酶启动子和ICP4基因之间插入长度为25bp的DNA片段，且ICP34.5位点插入了GFP表达盒，其中，DNA片段序列为AGCAGGACCTCGCCCTTGGGACGAC。该病毒具有选择性地高滴度繁殖力，病毒在肺癌细胞繁殖滴度稳定在10⁶以上。本发明用合成的随机核苷酸短序列与HSV1‑hTERTp_ICP4病毒基因组进行定点重组(在hTERTp与ICP4之间)。短序列的改变不但可以增加病毒的繁殖滴度，还可以使不同病毒针对不同类型肿瘤细胞产生选择性地高滴度繁殖。如有的病毒在肺癌细胞繁殖较好，有的病毒则在肝癌细胞产生更高的滴度等等。

技术领域

本发明涉及重组单纯疱疹病毒，具体地指一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP及其对应的诊断试剂盒。

背景技术

端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，其作用是维护染色体结构稳定，包括防止染色体末端融合，保护染色体结构基因和避免遗传信息在复制中丢失。端粒酶是由小分子RNA和蛋白质组成的逆转录酶,能利用自身RNA为模板合成端粒DNA,弥补随细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒。其有三个主要组成部分：人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相关蛋白(telomerase-associated protein,TP1/TLP1)、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。端粒酶RNA在大多数细胞中都表达,而人端粒酶逆转录酶是端粒酶的限速成分，仅在端粒酶阳性的细胞中表达，与端粒酶活性相关。尽管一些肿瘤细胞在重组时通过替代性端粒延长(alternative lengthening oftelomeres,ALT)机制来维持端粒长度,但仍有90％以上的肿瘤细胞通过上调hTERT来活化端粒酶，而且hTERT仅在极少数正常体细胞中表达。现已知端粒酶启动子(hTERTp)仅在端粒酶活性高的细胞中启动转录过程，这就为肿瘤靶向治疗提供了一个很好的契机。

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)表达的感染细胞蛋白(infectedcell proteins,ICPs)分为三个等级：初始(immediate early,IE)、早期(early)和晚期(late)。其中IE蛋白是影响病毒复制的关键蛋白，包括：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，而其中ICP4是最关键的复制相关蛋白。如果将ICP4基因的固有启动子置换成hTERTp，就有可能使HSV选择性地在肿瘤细胞内繁殖。

人工合成人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)以替换实验室现有I型溶 瘤单纯疱疹病毒(17+毒株)基因组中ICP4原启动子，构建出一种新型病毒HSV-hTERTp_ICP4。该重组病毒能选择性地在人肿瘤细胞内生长繁殖，而不在人的正常细胞中繁殖。

构建含hTERTp_ICP4表达盒的质粒是构建的HSV-hTERTp_ICP4病毒的基础，用含hTERTp_ICP4表达盒的质粒，我们构建了原始的HSV-hTERTp_ICP4，该重组病毒虽然可以选择性地在肿瘤细胞内繁殖，但繁殖滴度较低(10⁴/ml)。

为了解决繁殖滴度较低的缺陷，迫切需要构建一种繁殖滴度较高的病毒。

发明内容

本发明所要解决现有病毒繁殖滴度较低的缺陷，提供了一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP，该病毒具有选择性地高滴度繁殖力，病毒在肺癌细胞繁殖滴度稳定在10⁶以上。

本发明还提供了一种由重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP制备得到的诊断试剂盒。