[发明专利]重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP及诊断试剂盒

权利要求书

1.一种重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，构建重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：

(1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP

a.用BHK细胞培养含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并纯化其基因组DNA；b.扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：

ICP4USf正向引物：ccctccagacgcaccggagtcggggg，

ICP4USr反向引物：

aagtcgactctagaggatcgatctctgacctgagattggcggcactgaggta

扩增出ICP4基因上游侧翼序列；

c.扩增ICP4基因下游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4DSr反向引物：

ICP4DSf正向引物：

aaaagtcgacctgcaggcatgctaacgaggaacgggcagggggc

ICP4DSr反向引物：aaaaaagcttgcatgcccacgtgcgcggggccagacgggct扩增出ICP4基因下游侧翼序列；

将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4 DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；

d.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：

首先，使用以下引物：

ICP4-1st正向引物：ttttttgaattcatggcgtcggagaacaagcagcgcc

ICP4-1st反向引物：tggagccaccccatggcctccgcgt

ICP4-2nd正向引物：cgacgccgcgcagcagtacgccctg

ICP4-2nd反向引物：cggcgggggcgggcccggcgcaccg

ICP4-3rd正向引物：cctcatgtttgacccgcgggccctg

ICP4-3rd反向引物：ttttttctcgagttacagcaccccgtccccctcgaac

以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分别将三段基因片段插入pSP73质粒的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，从三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；

e.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列所得；

f.将步骤d中得到的ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并连接到步骤e得到的pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

g.用SalI酶切步骤c得到的含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从步骤f得到的质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与酶切后待用的pICP4del质粒连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4；

h.构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从步骤f质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动子的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素的抗性和表达ICP4，用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞，经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选出表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞；

(2)剔除基因组中ICP4基因启动子并插入端粒酶逆转录酶启动子hTERTp启动子：

i.用BHK细胞培养含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并提取病毒基因组DNA；

ii.将步骤i中病毒基因组DNA与步骤(1)的c小步骤得到的质粒pICP4del-eGFP共转入步骤(1)的h小步骤得到的BHK-ICP4辅助细胞内，经同源重组，质粒pICP4del-eGFP中绿色荧光蛋白GFP表达盒置换了含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV的ICP4基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，纯化出重组病毒HSV-d4GFP；

iii.培养HSV-d4GFP病毒，并提取基因组DNA；

iv.将重组病毒HSV-d4GFP的基因组DNA和步骤(1)中g小步骤得到质粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共转入BHK-ICP4辅助细胞中，经同源重组，hTERTp_ICP4表达盒置换了重组病毒HSV-d4GFP的绿色荧光蛋白GFP表达盒，使新重组病毒的毒斑不发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选无荧光毒斑，纯化出重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4；

2)构建重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA

(1)按以下序列合成互补的、长度为145个碱基的DNA片段，分别为hp-ICP4正和hp-ICP4负，其中N序列为随机碱基，两侧翼已知序列一侧与HSV-hTERTp_ICP4上端粒酶逆转录酶启动子的3’端序列同源，另一侧与ICP4基因5’端序列同源；

hp-ICP4正：

CCGCGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCCCCGGCTCCCCGGGCCCCACCGACGGGCCG

hp-ICP4负：

CGGCCCGTCGGTGGGGCCCGGGGAGCCGGGGCGCTGCTTGTTCTCCGACGCCATGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGCGG

(2)构建重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA：

提取HSV-hTERTp_ICP4病毒基因组DNA与上述合成的DNA片段hp-ICP4正和hp-ICP4负同源重组，用肺癌细胞A549筛选，得到针对肺癌细胞高滴度的HSV-hTERTp_ICP4_LungCA，简称HSV_LungCA；

(3)培养纯化HSV_LungCA重组病毒并提取病毒基因组DNA，对端粒酶逆转录酶启动子与ICP4基因结合部测序，确定25个碱基的序列为AGCAGGACCTCGCCCTTGGGACGAC；

3)构建重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP

(1)构建穿梭质粒pdICP34.5-eGFP

A.用BHK-ICP4细胞培养HSV-hTERTp_ICP4，并纯化其基因组DNA；

B.扩增ICP34.5基因上游侧翼序列：以步骤A中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP34.5USf正向引物和ICP34.5USr反向引物：

ICP34.5USf：CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG

ICP34.5USr：

GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGCTCCTGACCGCGGG

扩增出ICP34.5基因上游侧翼序列；

C.扩增ICP34.5基因下游侧翼序列：以步骤A中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP34.5DSf正向引物和ICP34.5DSr反向引物：

ICP34.5DSf：

GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA

ICP34.5DSr：TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA

扩增出ICP34.5基因下游侧翼序列；

D.连接ICP34.5基因上下游侧翼序列：以步骤B和C得到的ICP34.5上下游侧翼序列为模版，用ICP34.5USf和ICP34.5DSr扩增连接ICP34.5基因上下游侧翼序列；

E.将上下游侧翼序列克隆到pSP72质粒上，构建pdICP34.5；

F.从pcDNA3.1-eGFP获得eGFP表达序列并插入到pdICP34.5的AfeI位点，得到pdICP34.5-eGFP；

(2)构建HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP

用A549细胞培养HSV-hTERTp_ICP4_LungCA，简称HSV_lungCA，并纯化其基因组DNA；将该基因组DNA与步骤(1)的F中质粒pdICP34.5-eGFP共转入肺癌A549细胞内，经同源重组，质粒pdICP34.5-eGFP中绿色荧光蛋白GFP表达盒置换了含有ICP34.5基因的单纯疱疹病毒HSV_lungCA的ICP34.5基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，纯化出重组病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP，简称HSV_LungCA-GFP。