[发明专利]一种中草药黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选新方法

说明书

技术领域

本发明属于中草药药物筛选领域，具体涉及一种中草药黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选新方法。

背景技术

许多中草药提取物含有黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制剂且疗效显著，毒副作用低，安全性高。因此，从中草药中筛选XOD抑制剂已成为当前研究热点。

目前，中草药XOD抑制剂筛选方法主要有紫外分光光度计法、HPLC法、质谱法等。这些方法都是通过对XOD的催化产物尿酸或超氧阴离子进行测定，因而都存在一定的缺陷：如紫外分光光度法需要大量的酶及待筛选成分；HPLC及质谱法需要复杂的样品预处理过程；此外还有可能产生假阳性或假阴性结果。因此，迫切需要开发更为简单、精确、灵敏的XOD抑制剂的筛选新方法。

酶催化反应的本质是电子按一定电子转移通道进行转移。XOD催化反应的电子转移通道包含四个活性中心：一个Mo活性位点，两个[2Fe–2S]簇，一个FAD辅酶因子。当XOD与底物结合，Mo接受来自黄嘌呤的两个电子，并经[2Fe–2S]簇传递给FAD产生FADH₂。当有抑制剂如别嘌呤醇存在时，抑制剂可与Mo活性位点结合；而非布索坦可阻碍底物与Mo活性位点结合，此时酶催化反应电子转移被阻抑。得益于纳米功能材料的发展，这种电子转移信号可以用电化学方法进行监测，因而黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤(XAN)氧化反应过程中的电子转移信号可用于构建中草药黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选。

发明内容

本发明的原理是基于酶的催化反应本质为电子转移，其目的是提供一种新的中草药黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)先将碳纳米材料修饰到电极表面，再将黄嘌呤氧化酶修饰到碳纳米材料修饰的电极表面；或将碳纳米材料与黄嘌呤氧化酶一起修饰到电极表面；

(2)修饰电极干燥后在通氮除氧的缓冲溶液中，采用电化学方法测定修饰电极对黄嘌呤的响应；

(3)基于黄嘌呤的信号变化筛选中草药黄嘌呤氧化酶抑制剂。

进一步地，具体操作步骤如下：

(1)将碳纳米材料用浓硫酸与浓硝酸进行超声处理，洗涤干燥后用水分散，再将碳纳米材料修饰到电极表面，之后干燥，将黄嘌呤氧化酶用水分散，再修饰到经碳纳米材料修饰后的电极表面；或将碳纳米材料与黄嘌呤氧化酶配成溶液一起修饰到电极表面，之后干燥，得到修饰后的电极；

(2)将步骤(1)得到的修饰后的电极放入通氮除氧的缓冲溶液中，加入黄嘌呤，静置吸附5分钟，采用电化学方法测定修饰电极对黄嘌呤的响应；

(3)将修饰电极冲洗干净后放入另一通氮除氧的缓冲溶液中，加入中草药化学成分，静置吸附5分钟，再加入黄嘌呤，静置吸附5分钟，采用电化学方法测定修饰电极对黄嘌呤的响应；

(4)同时，分别测定(2)、(3)中不加黄嘌呤与中草药化学成分时各实验的电化学背景信号；

(5)加入不同量的中草药化学成分，重复(3)、(4)操作；

(6)根据公式筛选中草药黄嘌呤氧化酶抑制剂：计算化学成分对黄嘌呤氧化酶的抑制活性：其中ΔI₀是不加样品的峰电流与其背景的电流差，ΔI₁是加样品的峰电流与其背景的电流差。

其中步骤(1)所述的碳纳米材料为碳纳米管或石墨烯，还可用碳纳米管或石墨烯与壳聚糖、聚苯胺等高分子材料的混合物代替碳纳米材料。

其中步骤(2)和(3)所述的电化学方法为循环伏安法或计时电流法。

本发明的筛选机理如说明书附图中图1所示。XOD催化XAN氧化电子转移机制见图1，图中圆圈代表XOD。首先，XAN与XOD的Mo位点结合，生成尿酸产物，Mo得到两个电子，然后将这两个电子通过[Fe₂-S₂]快速传递到FAD，FAD被还原成FADH₂。FADH₂的电子在特定的电位下可传递到电极，从而在电极上产生灵敏的电流信号。当有抑制剂存在时，抑制剂可与Mo结合或阻止XAN与Mo接近，从而使XOD电子转移通道被阻抑，XOD对XAN的响应电流信号降低。因此，通过观测XOD电子转移阻抑信号可以应用于XOD抑制剂的筛选。