[发明专利]超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用

说明书

本发明涉及被称作Tat相关蛋白质改造工程(TAPE)的方法，通过将靶蛋白和抗生素抗性蛋白连接到Tat信号序列并在大肠杆菌内表达它，筛选具有更高的溶解性和优异的热稳定性的靶蛋白，特别是源自人生殖细胞的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)，以及由TAPE法筛选的、具有溶解性和优异的热稳定性的、人或改造的VH和VL结构域抗体和人或改造的VH和VL结构域抗体支架。还提供了在由TAPE法筛选的人或改造的VH或VL结构域抗体支架中包括随机CDR序列的文库，以及其制备方法。海通了使用该文库筛选的具有靶蛋白质结合能力的VH或VL结构域抗体，包括该结构域抗体的药物组合物。

本申请为2012年8月22日递交的申请号为201280076586.9并且发明名称为“超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

以下公开涉及被称作Tat相关蛋白质改造工程(TAPE)的方法，通过将靶蛋白和抗生素抗性蛋白融合到Tat信号序列并在大肠杆菌内表达它，筛选具有更高的溶解性和优异的热稳定性的靶蛋白，特别是源自人种系的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)。本发明还涉及由TAPE法筛选的、具有优异的溶解性和热稳定性的、人重链可变结构域抗体(下文称为“VH结构域抗体”)和轻链可变结构域抗体(下文称为“VL结构域抗体”)和人或改造的VH和VL结构域抗体支架。此外，以下公开内容涉及VH和VL结构域抗体和抗体支架的氨基酸序列，以及编码所述氨基酸序列的多核苷酸。

在含有根据本发明筛选的人或改造的VH或VL支架的VH或VL结构域抗体具有相应的人或改造的VH或VL结构域抗体支架(不管CDR序列)的情况下，它仍保留溶解性和热稳定性。

此外，以下公开内容涉及在由TAPE法筛选的人或改造的VH或VL结构域抗体支架中包括随机CDR序列的文库，以及其制备方法。

此外，以下公开内容涉及使用所述文库筛选的、对靶蛋白质具有结合能力的VH或VL结构域抗体，所述结构域抗体的氨基酸序列，编码所述氨基酸序列的多核苷酸。

发明背景

片段化的小尺寸抗体因为它与全长单克隆抗体(mAb)的不同理化性质而是一种能够克服现有抗体疗法的局限性的有前途的抗体。存在单链抗体(scFv)、Fab(片段抗体结合)抗体、免疫球蛋白可变结构域抗体，例如VH或VL等作为一般抗体片段，以及串联scFv、双抗体、微型抗体等作为其修饰形式(Better et al.,Science 1988 240(4855):1041-3；Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1988 85(16):5879-83；Bird et al.,Science 1988 242(4877):423-6；Pei et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1997 94(18):9637-42；Iliades et al.,FEBS Lett.1997 409(3):437-41；Ward et al.,Nature 1989341(6242):544-6)。

抗体片段或小尺寸的抗体与全长单克隆抗体相比主要是丧失了Fc(可结晶片段)的功能，因此，没有由于Fc的存在而产生的预期效果，如，增加的循环半衰期、效应子功能等。

然而，小尺寸的片段化抗体被放大作为能够克服由于现有完整抗体的大尺寸造成的局限下一代抗体，所述局限例如对结构上隐藏的表位的可及性、药物渗透和生物分布、形式灵活性、高生产成本等(Zhao et al.,Blood 2007 110(7):2569-77；Holliger et al.,Nat.Biotechnol.2005 23(9):1126-36；Hudson et al.,Med.Microbiol.Immunol.2009198(3):157-74；Enever et al.,Curr.Opin.Biotechnol.2009 20(4):405-11)。

此外，各种抗体片段和小尺寸抗体的优点在于可以通过化学方法或重组蛋白融合的方法进行连接来实现双重或多重特异性。