[发明专利]开关型硫醇荧光标记试剂及其合成方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及荧光标记试剂，具体涉及一种开关型硫醇荧光标记试剂及其合成方法和应用。

背景技术

在硫醇化合物的高效液相色谱分析中，马来酰亚胺类荧光标记试剂具有独特的优势：(1)与传统的芳基卤化物、苯并呋喃磺酰卤等试剂相比，它们与硫醇反应速度快，在室温及生理pH下即可进行。(2)对巯基的选择性高，加成产物比较稳定。(3)自身无荧光或荧光很弱，在与硫醇加成后荧光增强，这种荧光开关效应极大地降低了检测过程中的背景信号干扰。

然而目前可应用的马来酰亚胺类荧光标记试剂数量有限，并且与硫醇加成产物荧光开关效应不明显，合成步骤复杂，因此有必要开发一种标记反应迅速、荧光开关效应好、合成方法简便的开关型马来酰亚胺类荧光标记试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种标记反应迅速、对硫醇选择性高、无背景干扰、合成方法简便的开关型硫醇荧光标记试剂；本发明同时提供其合成方法和应用。

本发明所述的开关型硫醇荧光标记试剂是以咔唑为荧光基团，马来酰亚胺为反应活性基团，其化学名为：N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺，其化学结构式是：

所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，包括以下步骤：

(1)将顺丁烯二酸酐溶解到乙腈中，常温下滴加含有3-氨基-9-乙基-咔唑的乙腈溶液进行反应，反应完毕，除去溶剂，得到中间体N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸；

(2)用乙酸酐将N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸溶解，加入无水乙酸钠进行反应，反应完毕冷却，再倒入水中淬灭反应，回收固体后，经干燥、重结晶得到目标产物N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺。

其中：

步骤(1)中顺丁烯二酸酐和3-氨基-9-乙基-咔唑的摩尔比为1.1～1.4:1。

步骤(1)中滴加完毕后，继续反应0.8～1小时。

步骤(1)中反应完毕后，通过旋转蒸发除去溶剂。

步骤(2)中无水乙酸钠与N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸的摩尔比为1:5～8。

步骤(2)中加入无水乙酸钠后，在100℃下反应0.8～1小时。

步骤(2)中采用乙腈重结晶三次。

所述的开关型硫醇荧光标记试剂的应用，即检测硫醇浓度的方法，包括如下步骤：

(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；配制5份硫醇标准品的乙腈溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的乙腈溶液；

(2)依次将50μL PBS缓冲溶液、100μL硫醇标准品的乙腈溶液和50μL N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应10分钟，反应完毕后，取10μL进入高效液相色谱仪中分析，设置荧光激发波长为274nm，荧光发射波长为363nm，得到硫醇标准品色谱图，以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度工作曲线；

(3)将样品用开关型硫醇荧光标记试剂标记后，进入高效液相色谱仪中分析，将所得到的峰面积代入硫醇浓度工作曲线中，即可求得样品中硫醇的浓度。

本发明的有益效果如下：

本发明的开关型硫醇荧光标记试剂是以咔唑为荧光团，马来酰亚胺为反应活性基团，其中马来酰亚胺环与咔唑荧光团直接相连，由于马来酰亚胺环的强吸电子效应，使标记试剂的量子产率显著下降，表现为无荧光。

本发明试剂自身不发荧光，可在中性条件下选择性地与硫醇化合物反应，生成具有强荧光的衍生产物，极大地降低硫醇检测过程中的背景干扰；标记反应具有高选择性，在生理pH值下只和硫醇发生反应；标记反应速度快，对硫醇的标记反应可在10分钟内完成；标记试剂合成步骤简单，化学性质稳定，产率较高，经分离提纯后，化学纯度达99.6％以上，具有标记反应速率快、标记产率高、对硫醇选择性高等优点，有利于增强硫醇类化合物分析的准确性和灵敏性，可应用于生命分析、环境分析、食品分析等研究领域中，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的合成路线图。

图2是实施例1N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的核磁¹HNMR图。

图3是实施例2试剂和其硫醇衍生物的荧光发射图。

图4是实施例3试剂与巯基化合物的反应路线图。

图5是实施例3试剂衍生5种硫醇标准品的色谱图。

具体实施方式