[发明专利]开关型硫醇荧光标记试剂及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种开关型硫醇荧光标记试剂，其特征在于：以咔唑为荧光基团，马来酰亚胺为反应活性基团，其化学名称是：N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺，其化学结构式是：

2.一种权利要求1所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将顺丁烯二酸酐溶解到乙腈中，常温下滴加含有3-氨基-9-乙基-咔唑的乙腈溶液进行反应，反应完毕，除去溶剂，得到中间体N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸；

(2)用乙酸酐将N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸溶解，加入无水乙酸钠进行反应，反应完毕冷却，再倒入水中淬灭反应，回收固体后，经干燥、重结晶得到目标产物N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺。

3.根据权利要求2所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于：步骤(1)中顺丁烯二酸酐和3-氨基-9-乙基-咔唑的摩尔比为1.1～1.4:1。

4.根据权利要求2所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于：步骤(1)中滴加完毕后，继续反应0.8～1小时。

5.根据权利要求2所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于：步骤(1)中反应完毕后，通过旋转蒸发除去溶剂。

6.根据权利要求2所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于：步骤(2)中无水乙酸钠与N-(9-乙基-咔唑)-马来酰胺酸的摩尔比为1:5～8。

7.根据权利要求2所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于：步骤(2)中加入无水乙酸钠后，在100℃下反应0.8～1小时。

8.根据权利要求2所述的开关型硫醇荧光标记试剂的合成方法，其特征在于：步骤(2)中采用乙腈重结晶三次。

9.一种权利要求1所述的开关型硫醇荧光标记试剂的应用，其特征在于：用于检测样品中硫醇的浓度。

10.根据权利要求9所述的开关型硫醇荧光标记试剂的应用，其特征在于包括以下步骤：

(1)配制pH＝7.4、浓度为10mM的PBS缓冲溶液；配制5份硫醇标准品的乙腈溶液，浓度分别为1μM、10μM、100μM、1mM、10mM；配制浓度为100mM的N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的乙腈溶液；

(2)依次将50μL PBS缓冲溶液、100μL硫醇标准品的乙腈溶液和50μL N-(9-乙基-咔唑)-马来酰亚胺的乙腈溶液加到2mL的安剖瓶中，于40℃的水浴中反应10分钟，反应完毕后，取10μL进入高效液相色谱仪中分析，设置荧光激发波长为274nm，荧光发射波长为363nm，得到硫醇标准品色谱图，以硫醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制硫醇浓度工作曲线；

(3)将样品用开关型硫醇荧光标记试剂标记后，进入高效液相色谱仪中分析，将所得到的峰面积代入硫醇浓度工作曲线中，即可求得样品中硫醇的浓度。