[发明专利]稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、制备方法、应用、及猪瘟病毒亚单位疫苗

说明书

本发明涉及制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，包括以下步骤：提供重组表达质粒，其包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞进行多次传代培养，获得经传代培养的细胞克隆；检测该细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经多次传代培养后仍能表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列2所示。本发明还涉及稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、应用及猪瘟病毒亚单位疫苗。

技术领域

本发明属于分子生物学与兽用生物制品技术领域。具体而言，本发明涉及一种稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系及制备方法、所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用、包含所述重组细胞系的猪瘟病毒亚单位疫苗以及猪瘟病毒亚单位疫苗的制备方法。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的猪的一种急性高度致死性疾病，强毒株可导致易感猪100％发病，并导致50％以上的死亡率，国际兽疫局(OIE)将其定为必须通报的疫病，我国将其列为一类动物疫病。由于不同日龄、性别和品种的猪均可感染发病，因此猪瘟给养猪业造成巨大地经济损失。该病呈世界性分布，在各养猪国家都有不同程度的流行。目前在中国，猪瘟是影响养猪业的最重要的疾病。当前我国猪瘟发病状况具有多样性，流行范围较广，呈散发流行趋势。从感染情况看，发病日龄小，成年猪带毒现象严重，非典型和繁殖障碍型猪瘟增多。猪瘟经常与猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病、猪链球菌病、猪肺疫等混合感染，导致猪的死亡率增加。由于我国大多数生猪养殖企业规模较小，养殖技术和管理水平相对落后，猪的死亡率较高达近12％，由此造成的损失近百亿元，这也是导致近些年来猪肉价格不断升高的原因之一。

采用免疫接种是目前我国控制猪瘟的主要措施，疫苗质量的好坏直接影响疫病的免疫防治效果。现有技术中的猪瘟弱毒疫苗(C株)对世界范围内猪瘟防控发挥了卓著贡献。该疫苗目前仍被全世界多个国家所使用。猪瘟弱毒疫苗分为乳兔苗、免脾淋苗、原代细胞苗及传代细胞苗等。乳兔苗和脾淋苗又称为组织苗，是采用健康家兔生产制备的。组织苗的生产需要大量动物，且工艺复杂，成本高；原代细胞苗及传代细胞苗的生产也受到诸多因素困扰，如细胞培养用血清中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及抗体会干扰病毒生长，病毒生产滴度低、产量不稳定等。而且母源抗体干扰弱毒疫苗的免疫效果，这也是导致猪瘟疫苗免疫失败的因素之一。

CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40nm至60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，包含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个大的具有3898个氨基酸残基的多聚蛋白，该多聚蛋白的分子量约为438kDa。猪瘟病毒含有结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白包括C、E0、E1和E2蛋白。E2蛋白为CSFV的一种重要的囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白。E2蛋白诱导产生病毒的中和抗体，是猪瘟病毒主要的免疫保护性抗原，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷与不足，以及随着现代基因工程技术与细胞生物工程技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。

这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗。目前得到应用的有欧洲科研人员研制的以昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，该疫苗免疫不受母源抗体影响，而且可以与病毒感染进行抗体检测鉴别诊断。已有研究表明，用20μg昆虫细胞表达的E2油佐剂疫苗免疫猪，能抵抗CSFV强毒株的攻击。该疫苗已于上世纪九十年代在欧洲批准上市，在欧洲国家的猪瘟根除计划发挥了重要作用。