[发明专利]稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系、制备方法、应用、及猪瘟病毒亚单位疫苗

权利要求书

1.一种制备稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供重组表达质粒，该重组表达质粒包含彼此有效连接的猪瘟病毒E2蛋白编码序列和绿色荧光蛋白编码序列；

2)通过脂质体转染法将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入真核细胞；

3)通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞，并对该单克隆细胞利用悬浮培养法或静置培养法进行多次传代培养，获得经传代培养后的细胞克隆；

4)检测所述细胞克隆中猪瘟病毒E2蛋白的表达量，筛选出经所述多次传代培养后仍然能够表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系，其中猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系能够表达至少100ug/ml,

其中所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述编码猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白为猪瘟病毒C株E2蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述重组表达质粒与辅助质粒转染入HEK-293T细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过荧光检测法筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞的步骤包括：通过荧光显微镜观察经所述脂质体转染法转染的细胞，将表现出绿色荧光的细胞群体进行有限稀释，从而筛选出表达所述重组表达质粒的单细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多次传代培养为进行2-50次传代培养。

6.一种根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的重组细胞系。

7.一种猪瘟病毒亚单位疫苗，其包含有效剂量的由根据权利要求6所述的重组细胞系表达的猪瘟病毒E2蛋白和佐剂。

8.根据权利要求7所述的猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为矿物油佐剂。

9.根据权利要求7所述的猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述含猪瘟病毒E2蛋白的抗原液与佐剂的重量比为1:1至1:2。

10.根据权利要求9所述的猪瘟病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述猪瘟病毒亚单位疫苗每头份包含浓度为30ug至50ug的猪瘟病毒E2蛋白。

11.根据权利要求6所述重组细胞系在制备猪瘟病毒亚单位疫苗中的应用。

12.一种制备猪瘟亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将根据权利要求6所述的重组细胞系逐级放大培养至细胞密度为10⁷个以上时，连续收集培养上清液；

将所述上清液与佐剂按重量比1:1～1:2进行混合，所述佐剂为矿物油佐剂。