[发明专利]重组嗜酸乳杆菌S层蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其应用

说明书

本发明公开一种引物对。本发明公开一种嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白基因。本发明还公开一种重组菌株。本发明还公开一种重组蛋白。本发明还公开重组质粒pGEXS的构建方法。本发明还公开上述重组蛋白的提取纯化方法。本发明还公开重组质粒pGEXS、重组菌株，重组蛋白在拮抗H9N2禽流感病毒侵袭树突状细胞中的应用。本发明还公开一种试剂盒。本发明构建的表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的载体pGEXS中含有GST标签，从大肠杆菌中提取的S层蛋白与GST标签相连，可通过GST的柱子得到高度纯化的S层蛋白；与嗜酸乳杆菌ATCC 4356相比，重组大肠杆菌的S层蛋白表达产量更高，纯度达到95%。

技术领域

本发明涉及表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白的大肠杆菌，属于生物技术基因工程领域；具体包括：表达嗜酸乳杆菌ATCC 4356 S层蛋白质粒pGEXS的构建，表达的嗜酸乳杆菌ATCC 4356的S层蛋白的提取纯化，以及该重组表达的S层蛋白能够拮抗H9N2禽流感病毒侵袭鸡和小鼠树突状细胞。

背景技术

1、禽流感病毒利用树突状细胞发生免疫逃避的机制

禽流感(Aivan influenza，AI)是由禽流感病毒引起的禽类传染病，严重危害我国养禽业的健康发展和人类安全。疫苗预防和在黏膜部分阻断病毒入侵是防治禽流感病毒的主要方式，但目前我国禽流感疫苗接种后产生免疫应答的保护力难以防控禽流感的发生，疫苗接种后禽流感在部分区域仍然呈流行态势，这与禽流感病毒容易突变造成疫苗的失效密切相关。因此，高效阻断禽流感病毒对呼吸道黏膜的侵袭是防治禽流感的重要措施。

小鼠和鸡是研究禽流感病毒的模式动物，位于黏膜固有层中的树突状细胞作为机体功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)，可摄取、加工处理和递呈抗原，起着“哨兵”的作用。虽然禽流感病毒通过黏膜上皮细胞唾液酸α-2,3Gal受体介导侵袭，但树突状细胞对禽流感病毒的摄取和递呈是启动免疫应答的先决条件。DC-SIGN是位于树突状细胞表面的C型凝集素受体，研究发现DC-SIGN可通过自身的凝集素糖识别域(carbohydrate recognition domain，CRD)识别病毒表面的甘露糖和岩藻糖等糖类基团。人类免疫缺陷病毒(HIV-1)和SARS冠状病毒(SARS)均可通过与DC-SIGN受体结合，介导病毒利用树突状细胞参与免疫逃避。研究证实禽流感病毒同样可以通过与DC-SIGN结合，抑制树突状细胞的活化和对病原微生物的递呈，促进病毒在人源树突状细胞内的复制，并通过DC-SIGN直接将病毒颗粒传递给淋巴组织中其他易感细胞，从而发生病毒逃逸，给禽流感的防控增加了难度。

2、乳酸杆菌S层蛋白的研究进展

S层蛋白是古细菌和某些细菌(大约600余种细菌)表面的一层蛋白成分，分子量为40-200kD，能在菌体表面自装配为规则晶格的单分子层，以非共价键方式结合在细胞外膜上。研究已证实嗜酸乳杆菌ATCC 4356含有S层蛋白。乳酸杆菌S层蛋白的结构和生化特性与一般细菌S层蛋白有所不同，如等电点较高、分子量较小等。乳酸杆菌S层蛋白分子量在25-71kD之间，是目前已知S层蛋白中最小的一类，通常S层蛋白均为弱酸性蛋白，但乳酸杆菌S层蛋白呈强碱性，其等电点(pI)在9.35～10.4之间。虽然一些革兰氏阳性菌的S层蛋白大都为糖蛋白，但大部分乳酸杆菌S层蛋白则不具备糖基化的结构，为非糖蛋白。到目前为止，仅发现布氏乳酸杆菌(L.buchneri)的S层蛋白存在糖基化结构。

近年来有研究报道发现乳酸杆菌的S层蛋白具有拮抗病原菌侵袭机体的现象，但具体机制尚不清楚。研究发现，从卷曲乳酸杆菌分离的S层蛋白可以抑制产肠毒素大肠杆菌对层粘连蛋白和基质胶的粘附；与此同时卷曲乳酸杆菌对产肠毒素大肠杆菌也具有拮抗作用。但乳酸杆菌的S层蛋白能否拮抗病毒的侵袭的研究尚不完备。

3、S层蛋白可以特异性结合树突状细胞的机制