[发明专利]双泡状荧光探针及其应用和试剂盒

说明书

本发明公开了双泡状荧光探针及其应用和方法，该荧光探针从5'‑端至3'‑端依次包括锚定序列区Ⅰ，泡状结构Ⅰ、识别序列区、泡状结构Ⅱ和锚定序列区Ⅱ，所述锚定序列区Ⅰ和锚定序列区Ⅱ特异结合靶序列，所述识别序列区与靶序列检测位点杂交，所述泡状结构Ⅰ和泡状结构Ⅱ分别标记有相互作用性的荧光标记系统，且与靶序列杂交形成泡状结构，该探针结构简单，成本低，特异性好，能够用于基因定量分析、检测单碱基变异或检测高度同源性核酸靶分子。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及双泡状荧光探针，还涉及双泡状荧光探针在基因定量分析、检测单碱基变异或检测高度同源性核酸靶分子中的应用以及含有双泡状荧光探针的试剂盒。

背景技术

基因表达异常或基因突变常常与疾病相关，如导致恶性肿瘤的癌基因突变，因此基因表达量或基因突变检测对临床疾病监测具有重要意义。

现有的检测技术方法众多，主要为针对单碱基变异的荧光探针检测技术，如水解探针(hydrolysis probes；亦叫TaqMan探针)、杂交探针(hybridization probes)、分子信标(molecular beacons)等是最为常见，也是最为常用的检测技术。但是，上述探针对单碱基变异检测并不理想。一方面针对单碱基变异的上述探针设计难度大，针对同一种单碱基变异，通常需要设计几种以上探针，以便最终筛选到一条特异性最好的探针；另一方面由于杂交动力学原因，探针对单碱基变异的识别能力有限，特异性不理想，由于不同基因型对应的探针熔解温度(melting temperature，Tm)极为接近，且探针的整体Tm值较高，上述探针主要依赖于Tm值的微弱差异来控制探针对模板杂交的特异性；因此，针对单碱基变异的荧光探针往往能够与其它未变异的模板(或核酸分子)非特异性杂交，产生假阳性结果。对于单碱基变异中的单核酸酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，由于野生型或突变型丰度均较高(通常至少达到50％比例)，因此，现有探针检测技术对SNP检测的非特异性对检测结果并不存在太多干扰。但是，针对疾病相关的基因突变，如导致恶性肿瘤的癌基因突变，突变基因的丰度通常较低。随着个体化治疗的发展，对癌基因突变检测的灵敏度提出了极高的要求，要求至少能够检测突变丰度仅有1％左右的突变基因，并且，对肿瘤患者外周血游离DNA的检测灵敏度要求更高。由于存在非特异性杂交而产生的假阳性结果，现有探针技术并不适用于低丰度突变基因的检测需要。因此，急需一种灵敏度更高的探针，能够用于检测突变丰度仅有1％左右的突变基因。

发明内容

有鉴于此，为了解决现有探针检测低丰度突变基因灵敏度低，容易出现假阳性的问题，本发明首先提供在一种双泡状荧光探针，本发明的双泡状荧光探针设计简单，适用范围广，能够用于基因定量分析、单碱基变异检测、DNA或RNA甲基化分析、高度同源性的核酸靶分子的检测，具有高特异性识别能力，能够完全抑制非特异性杂交。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种双泡状荧光探针(图1)，所述荧光探针从5'-端至3'-端依次包括锚定序列区Ⅰ，泡状结构Ⅰ、识别序列区、泡状结构Ⅱ和锚定序列区Ⅱ，所述锚定序列区Ⅰ和锚定序列区Ⅱ特异结合靶序列，所述识别序列区与靶序列检测位点杂交，所述泡状结构Ⅰ和泡状结构Ⅱ分别标记有相互作用性的荧光标记系统，且与靶序列杂交形成泡状结构。探针的3’-末端可以连接有延伸阻断基团，其功能是阻止双泡状荧光探针在核酸扩增体系中的延伸。其阻断基团是在锚定序列区的3'-末端碱基位置修饰磷酸基团、氨基基团，或者在锚定序列区的3'-末端使用反转碱基或双脱氧核苷酸(dideoxynucleotide)。