[发明专利]一种三联核酸检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种三联核酸检测试剂盒，该试剂盒包括菌体裂解液，阳性定量反应液，阴性对照反应液及菌体检测反应液，所述菌体检测反应液中包含曲霉菌、新型隐球菌及白色念珠菌的特异性引物、特异性探针及内参荧光染料，三种特异性引物根据曲霉菌、新型隐球菌及白色念珠菌ITS序列的区域所设计，三种特异性探针的标记报告基团分别选用的是FAM、VIC和CY‑5，淬灭基团为MGB，FAM基团的激发波长为492nm，发射波长为517nm；VIC基团的激发波长为557nm，发射波长为574nm；CY‑5基团的发射波长为646nm，发射波长为664nm。本发明提供一种曲霉菌、新型隐球菌及白色念珠菌三联核酸定量检测试剂盒，辅助诊断曲霉菌、新型隐球菌、白色念珠菌的感染。

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR的核酸检测技术领域，具体是一种三联核酸检测试剂盒。

背景技术

目前深部真菌感染多由条件致病性真菌引起，多见于免疫力低下人群，病死率较高。其中，念珠菌引起的侵袭性真菌感染占所有病例的70％～90％，其中白色念珠菌又占念珠菌感染的70～80％；曲霉感染占真菌感染的10％～20％；而隐球菌中主要是新型隐球菌，是艾滋病患者合并感染的常见病原真菌，引起艾滋病患者的隐球菌性脑膜炎，治愈率极低。

目前，临床上常用的抗真菌药有5类，多烯类、唑类、棘白菌素类、氟胞嘧啶类和烯丙胺类。其中，最常用的药物主要包括氟康唑、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B、制霉菌素等。氟康唑、伊曲康唑是临床上治疗深部真菌感染的首选药物，氟康唑抗菌谱较窄，主要用于念珠菌、隐球菌感染的治疗，对曲霉等感染的疗效较差，且易产生耐药性。并且在临床上四种用药方式预防性用药、经验性治疗、抢先治疗和目标治疗中，对白色念珠菌、曲霉菌和新型隐球菌所用的药物都不尽相同。并且由于目前缺乏明确诊断依据，仍然抗生素滥用依然存在，然而抗生素滥用所导致的患者的耐药性，甚至导致患者无药可救，因此我们需要快速、准确的检测方法。

目前，真菌检测方法除了有培养法外，还有乳胶凝集实验、胶体金方法、和Elisa试验及G试验。培养法虽然是金标准，但是耗时长，阳性率低。乳胶凝集实验及胶体金方法灵敏度很高，但是其假阳性较高，且其乳胶滴度不能准确反映感染的情况，G试验只是检测真菌，不能区分不同的菌种，Elisa试验很容易出现假阳性结果，且操作复杂。荧光定量PCR的方法通过其定量可以直接反应患者的感染情况，并且能够进行定期检测达到指导预后的效果，对临床诊断具有标志性意义。

想要建立一种快速、灵敏、特异性的检测方法，以DNA为基础的PCR分子生物学的方法为最佳，其中荧光定量PCR的方法因其在灵敏度、特异性，操作上具有很大的优越性，因此在临床真菌检测中应用该方法，对真菌感染的早期治疗具有重大意义。将Q-PCR技术应用到真菌检测领域，填补国内空白，实现早期、快速和准确检测，为临床提供一种新的检测真菌的途径。在一次检测中同时完成对白色念珠菌、曲霉菌和新型隐球菌三种真菌的检测，更加全面的辅助临床诊断。该检测试剂盒配套便携式Q-PCR仪器进行检测，无需繁琐的设置运行程序，只需选择检测项目和标定样品名称，反应完毕后，后台软件针对性分析数据，直接给出检测报告，方便快捷。

目前公布CN201110214986.9和CN201410821483.1专利是有关于检测致病曲霉菌的通用引物、检测探针和试剂盒，其主要针对的是烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉四种致病曲霉菌进行检测；CN201110417477.6和CN201410017428.7这两个专利均是关于检测白色念珠菌的PCR荧光检测试剂盒；CN201410017251.0该专利是关于检测一种新型隐球菌的核酸检测试剂盒。以上几篇专利均是介绍的单一菌种的检测方法,没有达到像本发明这样多种真菌均属的同时检测。

CN201410820825.8该专利是关于常见致病真菌的检测方法，其主要是三个引物构成两对引物，两条探针构成的一种通用检测，其阳性结果代表曲霉菌、隐球菌、念珠菌、及米根霉和卷枝毛霉5种菌单一或混合感染，该方法是针对大类上真菌的检测，不具备像本发明能够鉴别是具体哪一种菌的能力。