[发明专利]甲氧基荧光素衍生物及其制备方法以及羧肽酶Y检测方法和检测试剂盒

说明书

本发明涉及羧肽酶Y的检测领域，具体涉及甲氧基荧光素衍生物及其制备方法以及羧肽酶Y检测方法和检测试剂盒。公开了甲氧基荧光素衍生物及其制备方法，甲氧基荧光素衍生物具有式(1)的结构，R为C1‑C10的烷基或环烷基；方法包括：在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)化合物与酰氯或酸酐中的一种接触。还公开了甲氧基荧光素衍生物在检测羧肽酶Y的活性中的应用及检测羧肽酶Y活性的方法。本发明的甲氧基荧光素衍生物用于与羧肽酶Y活性检测有关的应用时，灵敏度高、选择性好、荧光强度的变化大易于检测，稳定性更高、使用更方便、价格更低廉。

技术领域

本发明涉及羧肽酶Y的检测领域，具体地，涉及一种甲氧基荧光素衍生物及其制备方法以及羧肽酶Y检测方法和检测试剂盒。

背景技术

羧肽酶Y(EC号：3.4.16.1)，可水解所有具有羧基末端的氨基酸，已成为蛋白多肽链C末端分析中常用工具酶。此外羧肽酶Y还可通过转肽反应使其它氨基酸衍生物或亲核物质取代肽链末端的氨基酸残基，从而形成新肽。目前测定羧肽酶Y活性的主要方法主要有紫外吸收光谱法，该方法所需要的底物结构简单，操作方便，目前已经获得广泛使用，但是紫外方法存在以下两方面的缺陷：首先，紫外吸收光谱法的背景干扰大导致分析的灵敏度低；其次，用于分析的底物多为肽类，该类底物合成难度大，成本较高。第二种常用的方法为荧光分光光谱法，该方法主要以多肽类荧光探针为底物，反应灵敏度高于紫外分光光谱法，但用于分析的多肽底物合成难度大，成本高，且在常规条件下大都稳定性差，存储和允许条件苛刻，原子利用率低。

目前国内外还没有非肽类荧光探针用于检测羧肽酶Y的活性的报道。因此，设计开发基于非肽，廉价，操作简便且性质稳定的小分子探针来提高检测羧肽酶Y的灵敏度和选择性是非常迫切和需要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有羧肽酶Y活性检测技术中存在的缺陷，提供一种灵敏度高、性质稳定、操作简便、易于储运并且成本低廉的非肽类羧肽酶Y活性检测荧光探针和羧肽酶Y活性检测方法。

为达到上述目的，一方面，本发明提供了一种甲氧基荧光素衍生物，该甲氧基荧光素衍生物具有式(1)所示的结构，其中，R为C1-C10的烷基或环烷基；

第二方面，本发明还提供了如上所述的甲氧基荧光素衍生物的制备方法，该方法包括：在亲核反应条件和缚酸剂存在下，在有机溶剂中，将式(2)所示结构化合物与酰氯或酸酐中的一种接触；

其中，所述酰氯的通式为R’-C(＝O)Cl，R’与R具有相同的选择；

所述酸酐的通式为R”-C(＝O)-O-(O＝C)-R”，R”与R具有相同的选择。

第三方面，本发明还提供了如上所述的甲氧基荧光素衍生物在检测羧肽酶Y的活性中的应用。

第四方面，本发明还提供了检测羧肽酶Y活性的方法，其中，该方法包括：

将含有羧肽酶Y的待测样品与如上所述的甲氧基荧光素衍生物接触，得到接触后的物料；

检测接触后的物料在激发光下发出的荧光强度随时间的增加值，所述荧光强度的增加值指示了待测样品中羧肽酶Y的活性；所述激发光的波长为410-490nm，所述荧光的发射波长为505-555nm。

第五方面，本发明还提供了一种羧肽酶Y的活性的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：如上所述的甲氧基荧光素衍生物、羧肽酶Y标准品以及反应缓冲液。

本发明的甲氧基荧光素衍生物在用于检测羧肽酶Y活性时，与羧肽酶Y具有更高的亲和力和更高的选择性，检测灵敏度更高。

本发明提供的甲氧基荧光素衍生物荧光探针，在用于检测羧肽酶Y的活性时，与采用多肽类荧光探针相比，具有更高的灵敏度和选择性；且合成的方法简单快速，荧光背景值低。