[发明专利]用于构建融合蛋白的连接肽

说明书

技术领域

本发明涉及融合蛋白领域，更具体地，涉及一种用于构建融合蛋白的连接肽。

背景技术

近二十年，蛋白融合技术已广泛应用于构建双功能抗体、双功能酶和双功能蛋白等。然而，在构建融合蛋白过程中遇到了各种问题，例如在单独表达时能正确折叠的蛋白在融合蛋白中不能正确折叠；融合的两个蛋白因空间距离靠近从而导致活性位点被屏蔽；融合蛋白分子因不能正确折叠或其构象变化原因而容易被蛋白酶降解；原本具有一定柔性的蛋白催化域在融合之后失去了原有的功能等。这些问题的出现，往往导致融合蛋白活性降低甚至完全丧失。一般认为，构建融合蛋白后，原蛋白分子的活性会有一定程度的下降；一个有意义的融合蛋白是其各部分的活性保持在原蛋白分子的50％以上。为了解决以上问题，人们对融合蛋白的设计和构建进行了许多研究和探索，以期提高融合蛋白的活性。如通过改变融合蛋白的首尾顺序，变换不同的融合位点，采用不同的融合配体，或采用连接肽等方法。

相比于其它融合策略，使用连接肽(linker)具有多种优势。第一、组成连接肽的氨基酸具有多样性(20种常见氨基酸)，而且连接肽长度也是重要可调参数，由此可带来连接肽丰富的多样性(20的n次方种，n是连接肽的氨基酸残基数)，有利于对其进行工程改造；第二、连接肽能为两个待融合蛋白提供一定的空间间隔，以达到趋向于正确折叠而不相互干扰；第三、连接肽还能为两个待融合蛋白提供更多相互作用的可能性，促进相互间协同作用。

目前常用的连接肽有两种，螺旋形式的刚性连接肽(如A(EAAAK)_nA)和由低疏水性、低电荷效应氨基酸组成的柔性连接肽。螺旋形式的刚性连接肽能有效分开融合蛋白的不同功能区。柔性连接肽的例子包括Huston设计的(GGGGS)₃序列。另外，人绒毛膜促性腺激素(hCG)β链的羧基末端肽(以下称其为CTP)也有报道可以单独作为连接肽，主要用于连接同一个蛋白的不同亚基。例如，中国专利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公开的融合蛋白中，CTP作为接头，位于促卵泡激素的beta亚基和alpha亚基之间；专利WO2005058953A2公开的融合蛋白中，CTP作为接头，用于连接糖蛋白激素beta亚基和alpha亚基。但是，CTP因为具有延长某些蛋白体内半衰期的作用，因而在更多的专利文献中主要被公开作为融合蛋白中的延长半衰期部分，该部分可以选择使用免疫球蛋白Fc、CTP或其他能延长半衰期的融合配体。

有不少文献报道了连接肽序列对于融合蛋白构建和表达的影响。例如，在构建单链抗体1F7研究中，发现采用一个常规Genex212连接肽(GSTSGSGKSSEGKG)来连接其轻链和重链时，不能获得蛋白原有的催化活性，且蛋白不稳定；通过构建具有随机序列的连接肽(18个氨基酸残基)库进行筛选，才获得具有催化活性的单链抗体(Tang Y et al.,J Biol Chem.,1996,271(26):15682-15686)。Arai等在研究螺旋形式连接肽时，发现随着连接肽长度增加，从EBFP到EGFP的荧光共振能量转移减少，预示连接肽长度增加能有效分开两个功能区(Arai R等,Protein Engineering,2001,14(8):529-532)。另外，Luo等发现登革热病毒NS2B蛋白(N端为丝氨酸蛋白酶，C端为RNA解旋酶，连接肽为11个氨基酸残基的多肽)，通过在原173和174位点之间插入甘氨酸，或将174位的脯氨酸替换成甘氨酸，均导致两端蛋白活性的显著下降，表明其天然连接肽所具有的长度和刚柔性是长期进化的结果，对该天然融合蛋白的功能发挥具有重要意义(Luo D等,J Biol Chem.,2010,285(24):18817-18827)。

本发明人发现，连接肽长度及其氨基酸组成、是否含有糖基化位点、连接肽与两个活性分子间的适配性等多个方面都会影响融合蛋白的功能及稳定性。本发明人认为，连接肽应该具备以下特性：1)能使所连接蛋白实现有效折叠，使其处于适当构型，不引起分子动力学变化，且最好选择非免疫原性的天然氨基酸；2)应具备防蛋白酶攻击能力；3)应尽量避免融合蛋白两端氨基酸序列的互相干扰。

在对设计和构建连接肽缺乏明确指导原则的情况下，本发明人根据自身的长期研究经验，尤其是在对Fc融合蛋白的研究中受到启发，开发了新的用于构建融合蛋白的连接肽，令人意外的是，其更利于保持蛋白或多肽的生物活性，而且具有广泛适用性和可移植性。

发明内容