[发明专利]一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺

说明书

本发明公开了一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，所述提取工艺包括如下步骤：步骤a：菌体处理、步骤b：第一次提取、步骤c:第二次提取、步骤d：提取LPS。通过上述方式，本发明能够实现LPS的纯度提高，相比较现行技术的提取方法，具有在不增加新的设备和试剂的前提下，和不影响最终产品收率的前提下，提高LPS的纯度，并提高最终产品的纯度和安全性、有效性。

技术领域

本发明涉及医药制备领域，具体涉及一种提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺方法。

背景技术

随着医学技术的发展，伤寒Vi多糖疫苗的广泛应用，伤寒的发病率逐渐降低，但甲型副伤寒（副甲）疫情凸现，国内、外近几年来副伤寒引起的肠热症均有明显的上升趋势，发病人数的不断增加越来越引起人们的重视。

甲型副伤寒是一种肠道传染病，可通过生活用水、食物、苍蝇、蟑螂接触等传播引起流行。症状：开始有全身不适，食欲不好，头痛；发热，5～6日内体温可达40℃，持续不退；表情呆板，前胸和腹部上有红色疹状，肝脾肿大，有轻度压痛；重时可有肠出血、肠穿孔、心肌炎等合并症，有合并症者死亡率高。

曾有的伤寒、副甲、乙三联菌体疫苗副反应大，对副伤寒的预防免疫效果不确定，早已不再使用。随着副伤寒耐药菌株的增多，治疗难度也日渐增大，因此迫切需要新的副伤寒疫苗。但研究发现，甲型副伤寒沙门氏菌LPS脱毒后O-SP特异多糖作为免疫保护抗原的发现，为研制该疫苗提供了希望。O-SP特异多糖的纯化与荚膜多糖的纯化方法迥异，纯化过程更复杂，对仪器设备的要求高。

现有工艺中对甲型副伤寒沙门氏菌（LPS）的提取工艺如下：菌体称重，以重量体积比1：10加入注射水，捣碎后加入90%苯酚，水浴1小时后冷库过夜，然后离心并取上清液，透析袋透析后，加入MgCl₂和 NaAc，再加入乙醇至终浓度75%，离心收沉淀物，得到提取的LPS。但这种提取方法提取的LPS往往残留蛋白量较高，LPS纯度不够，会影响后续的水解收率。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明的主要目的是提供一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，该提取工艺能够有效降低残留蛋白含量，虽然在LPS收率上会略有降低，但LPS纯度提高了，后续水解产物以及纯度，均有提高。

为实现上述目的，本发明公开的技术方案如下：一种利用冷酚法提取甲型副伤寒沙门氏菌脂多糖的工艺，所述提取工艺包括如下步骤：

步骤a：菌体处理：取适量菌体称重后，按比例加入注射水，并将菌体捣碎；

步骤b：第一次提取：向步骤a处理后的菌体中加入苯酚，并在水浴中加热1-3 h，然后将得到的溶液置于冷库中过夜，然后离心分离，收取上清液；

步骤c:第二次提取：向步骤b中得到的上清液中加入冷酚，振摇8-20min后离心分离，收取上清液，并将上清液置于透析袋中透析；

步骤d：提取LPS：向步骤c透析后的溶液中加入MgCl2和 NaAc，至终浓度为0.1-0.3mol/l MgCl2和 0.02-0.05mol/l NaAc；再向其中加入乙醇至终浓度75%，离心分离，收集沉淀，得到粗提LPS。

优选的，所述步骤a中，菌体与注射水的用量比是1：（8-10）。

优选的，所述步骤b中苯酚的用量与菌体的用量比是（1-2）：（1-3）。

优选的，所述步骤b中加入的是浓度为90%的苯酚。

优选的，所述水浴的温度维持在60-70℃之间。

优选的，所述步骤c中加入70%浓度的冷酚，所述冷酚与所述上清液的用量比是（1-2）：（1-3）。

优选的，所述步骤d中加入1mol/L MgCl₂和 3mol/ L NaAc。