[发明专利]一种用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，属于药物筛选领域。

背景技术

血管生成是通过人体中存在的诸多互补和复杂的信号途径调节的，与很多疾病的发生和治疗有关。血管生成除可影响肿瘤的发生外，在其他一些疾病，如视网膜病变、风湿性关节炎、动脉粥样硬化、子宫内膜异位症等的发生中也起重要作用。阻止病理状态下的血管生成也已经成为该类疾病的新途径。

研究表明，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)可直接作用于血管内皮细胞，刺激其发生有丝分裂，从而促进新生血管的生长，是最重要的血管形成因子。VEGF是内皮细胞的特异性生长因子，并且是最特异和最关键的血管生成刺激因子，几乎参与了生理性和病理性血管形成的每一步，可以直接作用于血管内皮细胞，刺激其发生有丝分裂，从而促进新生血管的生长。结直肠癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤细胞均有自分泌VEGF的功能，发生游走转移的肿瘤细胞在局部可以释放VEGF刺激局部血管的形成。VEGF及其受体在多种肿瘤中表达，而在血管生成活跃组织(如肿瘤等)以外较少表达。因此，在肿瘤等病理状态下，VEGF高表达是最为重要的病理学特征。

实验模型是药物研发的重要环节。实验模型的有效性，可决定药物发现的效率，降低研发风险。目前血管生成的体外研究模型，主要是用体外细胞培养的方法，进行内皮细胞培养，观察其对血管生成的影响。血管生成的体内研究模型主要有动物(大鼠，兔等)眼角膜囊(眼前房)、地鼠颊囊、裸鼠外耳皮下和鸡胚绒毛尿囊膜等动物模型。血管生成的体外模型不能很好地反应体内所处的复杂内环境，评价结果的准确性较差。血管生成的体内动物模型研究更为接近人体，但操作繁琐，耗时过长。

而新兴的实验动物斑马鱼体现了良好的应用前景。斑马鱼具有体积小，产卵量高，发育成熟时间短，体表富有通透性，饲养条件简单，易于培养等特点，从而可以缩短药物筛选的实验周期，提高筛选效率；减少筛选过程中对受试样品的需要量，有利于微量先导化合物样品的活性筛选实验；可直接将受试药物投入培养基中进行实验，能同时进行多水平多因素的筛选。因此，斑马鱼在用于药物筛选的操作中便捷且经济。同时斑马鱼具有体外受精和个体透明的特征。利用这种特征，可实现在共聚焦显微镜下进行活体观察，既可动态观察其胚胎发育全程以及外源性物质对血管发育的影响，又可进行基因水平上的操作。但是遗憾的是，目前利用斑马鱼模型建立的血管生成模型均为直接观察新生的血管，是在生理状态的血管新生，从严格意义上讲，并不能有效区分正常的血管生成和病理状态下的血管生成。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，该方法建立在病理状态下，可以准确快速评价药物对血管的生成。

术语说明：

完全肠下外缘静脉长度：肠下外缘静脉以及肠下外缘静脉上生出的棘突长度的总和，见图1。

hpf(hours post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的时间，如48hpf指受精后48小时的胚胎。

本发明的技术方案如下：

发明概述：

本发明采用血管内皮生长因子(VEGF)处理特定时期斑马鱼幼鱼，模拟病理状态，然后以“完全肠下外缘静脉长度”作为评价指标，成功建立了药物对病理状态血管生成作用的评价方法，具有操作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点。

发明详述：

一种用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)将受精后48h的发育正常转基因斑马鱼胚胎移入培养孔中，加入血管内皮生长因子进行处理，得VEGF处理斑马鱼胚胎；将受精后48h的发育正常斑马鱼胚胎不经血管内皮生长因子处理为正常斑马鱼胚胎；

(2)一组VEGF处理斑马鱼胚胎连续给药孵育至72hpf，作为加药组，另外一组VEGF处理斑马鱼胚胎加入等量的培养水孵育至72hpf，作为VEGF组，正常斑马鱼胚胎加入培养水孵育至72hpf，作为正常对照组；

(3)麻醉加药组、VEGF组及正常对照组的斑马鱼，采集每条斑马鱼肠下静脉(SIVs)区域的荧光显微图像，测量每组每条鱼的完全肠下外缘静脉长度；

(4)定量分析

得到的每组斑马鱼完全肠下外缘静脉长度以表示，分析比较正常对照组、VEGF组、加药组之间差异的显著性；