[发明专利]一种用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法

权利要求书

1.一种用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，包括步骤如下：

（1）将受精后48h的发育正常转基因斑马鱼胚胎移入培养孔中，加入血管内皮生长因子进行处理，得VEGF处理斑马鱼胚胎；将受精后48h的发育正常斑马鱼胚胎不经血管内皮生长因子处理为正常斑马鱼胚胎；

（2）一组VEGF处理斑马鱼胚胎连续给药孵育至72hpf，作为加药组，另外一组VEGF处理斑马鱼胚胎加入等量的培养水孵育至72hpf，作为VEGF组，正常斑马鱼胚胎加入培养水孵育至72hpf，作为正常对照组；

（3）麻醉加药组、VEGF组及正常对照组的斑马鱼，采集每条斑马鱼肠下静脉SIVs区域的荧光显微图像，测量每组每条鱼的完全肠下外缘静脉长度；

（4）定量分析

得到的每组斑马鱼完全肠下外缘静脉长度以表示，分析比较正常对照组、VEGF组、加药组之间差异的显著性；

当加药组斑马鱼的小于VEGF组斑马鱼的，且达到统计学上的显著性水平P<0.05，说明待测药物对VEGF处理斑马鱼的血管生成具有抑制作用。

2.根据权利要求1所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述斑马鱼胚胎为血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎。

3.根据权利要求1所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，步骤（1）中，培养液中血管内皮生长因子的浓度为1-10 ng/mL。

4.根据权利要求1所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，步骤（1）中，血管内皮生长因子加入前需要对斑马鱼胚胎进行脱卵膜处理。

5.根据权利要求4所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，脱卵膜处理具体为将斑马鱼胚胎加入到浓度1-2mg/mL的链酶蛋白酶E溶液中保持2-5min，即可完成脱卵膜处理。

6.根据权利要求1所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，步骤（1）中，VEGF处理斑马鱼胚胎的具体处理方法为，将血管内皮生长因子水溶液加入到培养孔中，使孔中血管内皮生长因子浓度达到1-10 ng/mL，共同孵育4-12h，造成新生血管的异常增生的病理状态，然后移除VEGF；血管内皮生长因子水溶液的浓度为90~100 ng/mL。

7.根据权利要求1所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，步骤（2）中，加药组、VEGF组及正常对照组的斑马鱼胚胎于28℃控光培养孵育至72hpf，每组斑马鱼10-20条。

8.根据权利要求1所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，步骤（3）中，斑马鱼的麻醉为采用质量浓度为0.3‰的三卡因浸泡40～90s进行麻醉；步骤（3）中，采集图像为将斑马鱼胚胎固定侧面体位固定，在荧光显微镜下观察、拍照，获得斑马鱼胚胎的侧位图像，图像格式为jpg格式。

9.根据权利要求1所述的用于评价化合物对病理状态下血管生成作用的方法，其特征在于，步骤（3）中测量长度为利用图像处理软件Image J对采集的图像进行测量，测量前先校准标尺，得到准确的长度。

10.权利要求1所述的方法筛选出的待测药物为香附子挥发油、香附醇或丹皮酚。