[发明专利]一种食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法

说明书

本发明公开了一种食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法。包括将食管鳞状细胞癌ESD术后的福尔马林固定石蜡包埋标本(FFPE标本)分别制作成HE玻片和PEN玻片，对HE玻片上的FFPE标本进行病理分级标记，将PEN玻片上的FFPE标本进行脱蜡水化处理，然后将分级标记的HE玻片上的分级区域拓印到脱蜡水化后的PEN玻片上；将拓印后的PEN玻片在激光显微切割仪下按照拓印区域进行切割分离，切割分离后的组织依次进行蛋白质的提取定量和蛋白质的纯化酶解得到各个分级区域的蛋白质；各个分级区域的蛋白质再通过四级杆轨道离子阱质谱进行质谱分析，将质谱分析结果通过MaxQuant software environment(version1.4.3.9)软件进行label‑free搜库分析得到蛋白质的比对结果和蛋白质筛选结果。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法。

背景技术

食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)在我国属于高发的恶性肿瘤,ESCC的发展是一个多步骤过程结果，它由正常鳞状上皮向上皮内瘤变发展再到最后的浸润性癌。2000年世界卫生组织将上皮内瘤变分为两类：低级别上皮内瘤变(LGIEN),高级别上皮内瘤变(HGIEN)。有研究表明LGIEN、HGIEN与正常食管鳞状上皮相比发展为鳞状细胞癌的风险分别高出10倍和28倍，因此成功的区分HGIEN、 LGIEN，利用癌前各阶段分子标志物对患者组织进行识别将对ESCC的初级预防与药物治疗提供机会。但是现有的研究多利用新鲜或者石蜡包埋的食管鳞状细胞癌手术组织及癌旁组织作为研究的对象，对这些样本进行差异蛋白质方面的研究。而对于癌前不同病变阶段的差异蛋白质鲜有研究。这种现状主要由以下几个原因造成：一、对于纯净石蜡组织样本的获得还是有一定的技术难度。二、对纯净石蜡包埋组织中蛋白质的提取与鉴定尚且没有形成通用的实验方法。三、纯净组织获得的不易，直接导致只能对癌和癌旁组织进行粗略的区分，而无法真正对癌前各阶段的差异蛋白质进行研究，也就无法发现能通用的癌前分子标志物，对ESCC进行有效的初级预防。所以，纯净癌前各阶段组织的获得技术以及差异蛋白质鉴定筛选技术对癌前分子标志物的发现至关重要。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是给出一种食管鳞状细胞癌前LGIEN 和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，利用该蛋白质能准确的区分病人病理切片上的LGIEN和HGIEN，颠覆了传统通过HE染色依赖医生经验进行判读的方法，避免了人为主观因素的干扰；且得到了一种通用的、更加准确的筛选区分食道鳞状细胞癌前 LGIEN和HGIEN的蛋白质的方法。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，包括将同一FFPE组织制作成至少两个玻片标本，其中一个玻片标本经HE染色后进行等级组织划分并标记，另一个玻片标本根据经HE染色后进行等级组织划分并标记的玻片标本上的划分区域进行组织切割得到各个等级组织的切割组织；之后对得到的各个等级组织的切割组织依次进行蛋白质的提取、定量、纯化与酶解得到各个等级组织的肽段；最后将得到的各个等级组织的肽段分别经LC-MS/MS进行质谱检测，对质谱检测结果进行统计学分析和生物信息学分析得到LGIEN和HGIEN的标记蛋白质。

具体的，包括：

步骤一、对目标组织进行LCM激光捕获：将食管鳞状细胞癌ESD术后的同一FFPE 组织分别制作成HE玻片标本和PEN玻片标本，根据染色的区别将HE玻片标本进行等级组织划分并进行标记，根据HE玻片标本上的标记区域对脱蜡水化后的PEN玻片标本进行LCM激光显微切割得到各个等级组织的切割组织；

步骤二、将步骤一得到的各个等级组织的切割组织依次进行蛋白质的提取、定量、纯化与酶解得到各个等级组织的肽段；