[发明专利]一种食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法

权利要求书

1.一种食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，其特征在于，包括将同一FFPE组织制作成至少两个玻片标本，其中一个玻片标本经HE染色后进行等级组织划分并标记，另一个玻片标本根据经HE染色后进行等级组织划分并标记的玻片标本上的划分区域进行组织切割得到各个等级组织的切割组织；

所述的FFPE组织为食管鳞状细胞癌ESD术后的同一FFPE组织；

所述的组织切割为LCM激光显微切割；

之后对得到的各个等级组织的切割组织依次进行蛋白质的提取、定量、纯化与酶解得到各个等级组织的肽段；

所述的蛋白质的提取采用PEB试剂进行提取，PEB试剂包括300mM的Tris-HCL溶液，Tris-HCL溶液中含有体积百分比为2％的SDS，Tris-HCL溶液的pH＝8.0；

最后将得到的各个等级组织的肽段分别经LC-MS/MS进行质谱检测，对质谱检测结果进行统计学分析和生物信息学分析得到LGIEN和HGIEN的标记蛋白质。

2.如权利要求1所述的食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，其特征在于，包括：

步骤一、对目标组织进行LCM激光捕获：将食管鳞状细胞癌ESD术后的同一FFPE组织分别制作成HE玻片标本和PEN玻片标本，根据染色的区别将HE玻片标本进行等级组织划分并进行标记，根据HE玻片标本上的标记区域对脱蜡水化后的PEN玻片标本进行LCM激光显微切割得到各个等级组织的切割组织；

步骤二、将步骤一得到的各个等级组织的切割组织依次进行蛋白质的提取、定量、纯化与酶解得到各个等级组织的肽段；

步骤三、步骤二得到的各个等级组织的肽段分别经LC-MS/MS进行质谱检测，对质谱检测结果进行统计学分析和生物信息学分析得到LGIEN和HGIEN的标记蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，其特征在于，所述的等级组织包括正常食管鳞状上皮组织、LGIEN、HGIEN和原位癌组织。

4.如权利要求1所述的食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，其特征在于，所述的蛋白质的提取方法包括：按照100mm²的待提取等级组织、100μl PEB试剂及4μl的cocktail蛋白酶抑制剂进行混合，在90℃孵育90min后，4℃下16000xg离心20min收集上清液，上清液在12,000xg～16000xg的转速下离心30～40min得到沉淀物为粗提蛋白质；粗提蛋白质再经定量、纯化与酶解得到各个等级组织的肽段。

5.如权利要求2所述的食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，其特征在于，所述的PEN玻片标本的脱蜡水化包括：将PEN玻片依次在二甲苯中浸泡10min并重复两次、在无水乙醇中浸泡10min并重复两次，之后在96％的乙醇中浸泡3min并重复两次、70％的乙醇中浸泡3min并重复两次，最后将PEN玻片标本上的溶剂冲洗干净风干即得。

6.如权利要求1或2所述的食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法，其特征在于，所述的统计学分析和生物信息学分析包括：

生物学分析：利用MaxQuant software environment version1.4.3.9软件进行label-free分析，肽段的假阳性检出率设置为0.01，检出数据在Uniprot数据库进行筛选，筛选所有unique peptide+razor≥1的蛋白质；

统计学分析：对经生物学分析得到的蛋白质进行多个个体的重合筛选及差异表达分析，在差异表达分析的结果中筛选与HGIEN和LGIEN相比有统计学差异意义的蛋白质即得食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质。

7.权利要求1、2、3、4、5或6所述的食管鳞状细胞癌前LGIEN和HGIEN的标记蛋白质的筛选方法得到的蛋白质用于区分LGIEN和HGIEN的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将筛选得到的蛋白质的抗体通过IHC染色法对病理切片进行染色，通过染色后着色强弱的区别进行LGIEN和HGIEN的区分。