[发明专利]一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鞘氨醇单胞菌，以及一种通过电击对鞘氨 醇单胞菌进行遗传转化的方法。

背景技术

鞘氨醇单胞菌是一类丰富的新型微生物资源，其在地球上分布极其广泛，在各种水 体，土壤，大气以及极端环境都有它存在的踪影。鞘氨醇单胞菌从属与a‐变形菌纲，鞘 氨醇单胞菌目，鞘氨醇单胞菌科。该属菌株为革兰氏阴性菌，无孢子，以单侧生极性鞭 毛运动，多呈黄色，专性需氧且能产生过氧化氢酶。鞘氨醇单胞菌自身具有很强的代谢 能力，可以降解芳香族化合物，对于保护环境具有潜在应用价值；该属某些菌株胞外能 够合成有价值的胞外生物高聚物，具有很高的经济利用价值；同时该属某些菌株胞内可 以合成多种具较强抗氧化能力的类胡萝卜素，在工业生产上具有很高的应用价值。因此， 鞘氨醇单胞菌目前受到了广泛的重视与研究。通过DNA重组技术向其导入外源DNA片段 以研究鞘氨醇单胞菌降解芳香族化合物相关基因已成为研究其降解机制的重要手段，同 时，根据应用微生物学，为提高生物高聚物，类胡萝卜素产量，将外源限速酶基因导入 其体内也是一个重要应用手段。

常见对鞘氨醇单胞菌的基因转化，是通过三亲结合的方法将外源基因导入菌体内， 但该方法存在周期长，操作复杂，转化效率低，可重复性差等缺点。通过电穿孔转化方 案，即利用脉冲电场造成细胞壁的改变从而将外源DNA导入细胞内，可以克服三亲结合 转化法带来的困难。但由于常用质粒的复制子在鞘氨醇单胞菌中都无法复制的原因，无 法实现将质粒或携带外源基因的质粒导入鞘氨醇单胞菌并使其在体内复制。因此，寻找 鞘氨醇单胞菌兼容性复制子是基因转化的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种鞘氨醇单胞菌，以及利用电击法将外源基因转化到鞘氨醇 单胞菌体内的新方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种鞘氨醇单胞菌，保藏号为CGMCC No.12394。

一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，包括以下步骤：

(1)构建电击转化鞘氨醇单胞菌所需质粒；

(2)制备鞘氨醇单胞菌感受态细胞；

(3)电击转化鞘氨醇单胞菌感受态细胞，转化后培养；

(4)转化用于遗传改造效果的验证。

根据所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其中步骤(1)中所述电击转化鞘氨 醇单胞菌所需质粒是由将鞘氨醇单胞菌内源质粒复制子与pHSG398质粒连接所构成。

根据所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其中所述步骤(1)中电击转化鞘氨 醇单胞菌所需质粒是由将鞘氨醇单胞菌内源质粒或内源质粒上任何长度带有复制子的 DNA片段或基本上同源的一段DNA序列与pHSG398质粒连接所构成。

根据所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其中所述步骤(2)制备鞘氨醇单胞 菌感受态细胞是将鞘氨醇单胞菌接种至LB培养基内，于28℃摇床孵育至吸光度 OD_600nm＝0.6-0.9，离心收集，使用预冷的10％甘油洗两遍，于-80℃冻存。

根据所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其中所述步骤(3)电击转化鞘氨醇 单胞菌感受态细胞，采用电击条件为2.0KV-2.5KV，脉冲时间为4.5-5.5ms。

根据所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其中所述步骤(3)转化后培养是向 电击后的鞘氨醇单胞菌感受态细胞加入TB培养基，震荡培养2-6小时。

根据所述的一种鞘氨醇单胞菌在对鞘氨醇单胞菌的遗传改造中的应用，是将由鞘氨 醇单胞菌内源质粒上任意片段或基本同源的一段DNA序列组成的质粒，用于对鞘氨醇单 胞菌的遗传改造。

根据所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，该方法包括下述步骤：

(一)构建转化所必须的质粒：

1、鞘氨醇单胞菌内源质粒的提取由常用质粒抽提试剂盒实现，将获得的内源质粒分 别用限制性内切酶BamH Ⅰ，EcoR Ⅰ，Sal Ⅰ进行消化，分别获得长度为6kb，5kb，3kb 的DNA片段，其三者共同特征是都含有内源质粒的复制子；

2、将带氯霉素抗性的质粒pHSG398分别用限制性内切酶BamH Ⅰ，EcoR Ⅰ，Sal Ⅰ进 行消化，与(1)获得的三种不同大小的DNA片段进行连接，构建得到三种不同大小的 的质粒pHSG398‐RepB，pHSG398‐RepE，pHSG398‐RepS；

(二)制备感受态细胞：