[发明专利]一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法

权利要求书

1.一种鞘氨醇单胞菌，保藏号为CGMCC No.12394。

2.一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，包括以下步骤：

(1)构建电击转化鞘氨醇单胞菌所需质粒；

(2)制备鞘氨醇单胞菌感受态细胞；

(3)电击转化鞘氨醇单胞菌感受态细胞，转化后培养；

(4)转化用于遗传改造效果的验证。

3.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：步骤(1)中所述电击转化鞘氨醇单胞菌所需质粒是由将鞘氨醇单胞菌内源质粒复制子与pHSG398质粒连接所构成。

4.根据权利要求3所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(1)中电击转化鞘氨醇单胞菌所需质粒是由将鞘氨醇单胞菌内源质粒或内源质粒上任何长度带有复制子的DNA片段或基本上同源的一段DNA序列与pHSG398质粒连接所构成。

5.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(2)制备鞘氨醇单胞菌感受态细胞是将鞘氨醇单胞菌接种至LB培养基内，于28℃摇床孵育至吸光度OD_600nm＝0.6-0.9，离心收集，使用预冷的10％甘油洗两遍，于-80℃冻存。

6.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(3)电击转化鞘氨醇单胞菌感受态细胞，采用电击条件为2.0KV-2.5KV，脉冲时间为4.5-5.5ms。

7.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：所述步骤(3)转化后培养是向电击后的鞘氨醇单胞菌感受态细胞加入TB培养基，震荡培养2-6小时。

8.根据权利要求1所述的一种鞘氨醇单胞菌在对鞘氨醇单胞菌的遗传改造中的应用，其特征在于将由鞘氨醇单胞菌内源质粒上任意片段或基本同源的一段DNA序列组成的质粒，用于对鞘氨醇单胞菌的遗传改造。

9.根据权利要求2所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：该方法包括下述步骤：

(一)构建转化所必须的质粒：

1、鞘氨醇单胞菌内源质粒的提取由常用质粒抽提试剂盒实现，将获得的内源质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ进行消化，分别获得长度为6kb，5kb，3kb的DNA片段，其三者共同特征是都含有内源质粒的复制子；

2、将带氯霉素抗性的质粒pHSG398分别用限制性内切酶BamHⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ进行消化，与(1)获得的三种不同大小的DNA片段进行连接，构建得到三种不同大小的的质粒pHSG398‐RepB，pHSG398‐RepE，pHSG398‐RepS；

(二)制备感受态细胞：

1、从4℃冰箱中取出保藏的鞘氨醇单胞菌KIB,挑取至LB液体培养基中，于28℃,220rpm过夜培养15-18小时，活化菌体；

2、用移液枪吸取2.5ml步骤1的培养物在无菌超净台接种于50mlTB培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600nm＝0.8；

3、将步骤2的菌液冰浴10min后，放入离心管中，4℃/5000rpm离心5min，弃上清，收集细胞；

4、在无菌超净台上用4℃预冷的20ml的10％甘油通过移液枪吹悬步骤3得到的细胞，4℃、5000rpm离心5min，弃上清，收集细胞，漂洗2次；

5、在无菌超净台上用2ml10％甘油吹悬步骤4得到的细胞，分装于离心管中，-80℃保存；

(三)电击转化

1、取100ng步骤一所构建的三种不同大小的质粒pHSG398‐RepB，pHSG398‐RepE，pHSG398‐RepS，分别加入到步骤二制备的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使所述质粒DNA和感受态细胞充分混匀，冰浴2min；

2、将完成步骤1的体系转移至0℃预冷的1mm电击杯中，用电转仪进行电击，电压25KV/cm，时间常数＝5ms；

3、完成步骤2后，立即向电击杯中加入1mlTB培养基，混匀；

4、完成步骤3后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，28℃,220rpm振荡培养2-6小时；

5、将完成步骤4的培养体系涂布于含有终浓度为15μg/ml氯霉素的LB固体培养基平板，28℃培养48小时；

6、随机挑取生长出来的单克隆，提取质粒琼脂糖凝胶电泳，验证转化结果；

(四)转化用于遗传改造效果验证

1、将步骤一构建得到的pHSG398‐RepS质粒，用SmaⅠ酶切，回收得到的片段与从衣藻中克隆的酮化酶基因BKT连接，得到pHSG398‐RepS‐BKT质粒；

2、将pHSG398‐RepS‐BKT质粒，按步骤三电击转化鞘氨醇单胞菌，BKT基因在鞘氨醇单胞菌中表达，鞘氨醇单胞菌由原来的黄色变成了红色，超高效液相色谱分析，类胡萝卜素上的紫罗酮环上都加上了羰基，证明鞘氨醇单胞菌转化系统构建成功。

10.根据权利要求9所述的一种鞘氨醇单胞菌遗传转化的方法，其特征在于：其中所述转化内源质粒复制子DNA在3233bp-4641bp之间；鞘氨醇单胞菌转化后回复时间为2-6小时。