[发明专利]修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种修饰的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用，所述修饰的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰。其制备方法包括以下步骤：将N‑乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂进行反应，去除其氨基酸侧链的羧基；将去除羧基后的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶用盐酸胍进行修饰，即可。所述的修饰的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶可用于制备稳定的SA试剂盒。经过修饰后的酶活力更高，在试剂中稳定性更佳，同时不与还原型辅酶互相干扰，使得试剂的灵敏度更佳，可以检测到更微量的唾液酸，在值相对较低的样本检测中，准确度更佳。

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用，特别是涉及一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶的修饰方法和含该修饰酶的试剂盒。

背景技术

N-乙酰神经氨酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶催化下生成N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸，是唾液酸检测中重要的酶之一。

唾液酸是细胞膜糖蛋白的重要组成部分，与生物体的许多生物学功能有关，且与细胞恶变、癌转移、浸润、失去接触性抑制、细胞粘附性降低以及肿瘤抗原性密切相关。测定血清唾液酸(SA)浓度，可作为肿瘤诊断辅助性指标和疗效观察指标。

SA明显升高的疾病有：急性白血病、食道癌、贲门癌、胃癌、肠癌、肝癌、肺癌以及卵巢癌等，其中以急性白血病患者为最高。肿瘤患者血清唾液酸增高可能是肿瘤细胞涎糖蛋白合成增加和代谢的改变在血中的反映。

癌症患者SA水平动态变化与病情相关，可以用于早期发现肿瘤的转移和复发。

唾液酸检测的原理：样本中的唾液酸受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神经氨酸，进而在N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NANA-醛缩酶)的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺。丙酮酸在NADH存在下由乳酸脱氢酶(LDH)作用下生成乳酸和NAD+。测定该NADH的吸光下降的速率可求得样本中唾液酸浓度。

因为N-乙酰神经氨酸醛缩酶侧链还有羧基，羧基具有一定的氧化性，试剂2中含有还原型辅酶，长时间的储存会使还原型辅酶被N-乙酰神经氨酸醛缩酶氧化，导致了试剂的稳定性不佳。

目前，普遍的SA检测试剂盒的稳定性为6个月至10个月。主要原因便在于试剂中N-乙酰神经氨酸醛缩酶和还原型辅酶相互的影响。含使用本发明方法修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的试剂盒，稳定性能达到14个月，稳定性大大提高。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶的修饰方法和含该修饰酶的试剂盒。本发明提供一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶的修饰方法，同时利用该方法修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，发明了一种稳定的唾液酸检测试剂盒。该试剂盒灵敏度好、稳定性佳，测定结果准确可靠。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸侧链经烷基化修饰及酶空间结构修饰。

第二方面，本发明提供了一种修饰的N-乙酰神经氨酸醛缩酶的制备方法，包括以下步骤：

A1、将N-乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂进行反应，去除其氨基酸侧链的羧基；

A2、将去除羧基后的N-乙酰神经氨酸醛缩酶用盐酸胍进行修饰，即可。使用盐酸胍对N-乙酰神经氨酸醛缩酶进行修饰，可使酶分子重新折叠，改变其空间结构。

优选地，步骤A1中，所述烷基化试剂包括碳化二亚胺、碘乙酸和碘乙酰胺中的一种或几种混合。

优选地，步骤A1中，所述的反应具体为：使用三乙胺作为溶剂，N-乙酰神经氨酸醛缩酶与烷基化试剂以1:3～5的质量比混合，在室温下搅拌过夜。