[发明专利]硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用

说明书

本发明公开了一种硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5‑羟甲基胞嘧啶中的应用，其中所述的硼酸衍生物功能化荧光探针是表面固载2‑(4‑二羟基硼烷)苯基‑4‑羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球。本发明荧光探针不仅具有2‑(4‑二羟基硼烷)苯基‑4‑羧基喹啉的荧光特性，而且保留了聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球的良好生物兼容性，能够特异性吸附糖基化后的5‑羟甲基胞嘧啶，实现对5‑糖基化胞嘧啶的简单、快速、高灵敏度、低检出限检测。

技术领域

本发明属于DNA中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的检测技术领域，具体涉及一种可特异性识别顺式二羟基结构的2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)功能化荧光复合物传感材料(PBAQA-P_GMA)在检测DNA链中5hmC的应用。

背景技术

5-甲基胞嘧啶(5mC)在调控基因表达、基因组印记和X染色体失活中起着至关重要的作用。近来发现，5mC在TET(ten eleven translocation)家族双加氧酶Fe²⁺/α-酮戊二酸的催化作用下可以被氧化为5hmC。5hmC作为一种1952年被发现至2009年才被再次发现进而得到广泛研究的新型胞嘧啶变异体，目前已经被公认为是继5mC之后的第六种碱基。该碱基在生物生理学过程中有着至关重要的作用。研究证明，5hmC是DNA去甲基化过程的重要中间产物，它可能是一种可以独立存在较稳定的表观遗传修饰。研究还发现，在一些癌症诸如肺癌、脑癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、前列腺癌中5hmC的含量明显下降，证明其在癌症发展过程中扮演者重要的角色。除此之外，5hmC在亨廷顿舞蹈症、骨髓增生异常综合症、阿尔兹海默症这些疾病中的分布也表现出异常。这些发现均预示5hmC将可能成为一种疾病诊断、处理和治疗的新兴生物学标志。

目前很多特定的技术已经被用于检测组织中的5hmC，包括薄层色谱法、高效液相色谱串联二级质谱法、同位素标记法、抗原抗体酶联免疫技术等，但这些方法存在一些无法克服的缺点，比如需要用到放射性元素，无论是对人体还是环境都有害，检测仪器昂贵，操作繁琐等。基于此逐渐出现了光谱法检测5hmC，如：将5hmC中的羟甲基氧化为醛基，通过醛基将一些荧光基团标记到DNA链上进行荧光检测；氧化后通过荧光共振能量转移法进行荧光检测；通过糖基化反应将含有叠氮基团的糖基转移到5hmC DNA链上，通过生物素标记、链霉亲和素标记法进行荧光标记等。但这些荧光方法需要至少两步提纯过程，从而增大了DNA的损失率，而且操作过程繁琐，有些难以避免背景因素干扰。

公开号为CN 104483295A的发明专利申请公开了一种基于硼酸衍生物功能化荧光探针检测糖蛋白等二醇类物质的方法，该方法操作简单，检测灵敏度高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为硼酸衍生物功能化荧光探针提供一种新的应用。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：硼酸衍生物功能化荧光探针在检测5-羟甲基胞嘧啶中的应用，所述硼酸衍生物功能化荧光探针是表面固载2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球，其中聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球的粒径为150～400nm。

上述硼酸衍生物功能化荧光探针的制备方法为：将聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球(P_GMA)溶解于蒸馏水中，并加入过量乙二胺，在氮气保护下，80℃反应完全后，离心、洗涤、干燥，得到氨基功能化的P_GMA；将氨基功能化的P_GMA分散于无水乙醇中，并依次加入2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其中氨基功能化的P_GMA与PBAQA、EDC、NHS的摩尔量比为4:4:9:9，超声分散均匀，40℃反应完全后，离心分离，产物依次用超纯水、无水乙醇和乙腈洗涤，自然干燥，得到表面固载2-(4-二羟基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸环氧丙酯纳米微球(PBAQA-P_GMA)，即硼酸衍生物功能化荧光探针。