[发明专利]一种金‑上转换纳米粒子三聚体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法及其应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP），是一种致癌糖蛋白，是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。大量的临床发现，70%-95% 的原发性肝癌患者的AFP 升高。粘蛋白-1（Mucin-1）发生在许多腺癌，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和其它组织。粘蛋白也过度表达在肺疾病，如哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺病或囊性纤维化。Mucin-1正诊断标记为恶性肿瘤和其他疾病过程中，通常会过度或错误表达。

传统检测癌症标志物的方法有：酶联免疫法、电化学和基于仪器的液质联用、高效液相色谱等。酶联免疫法检测肿瘤标志物时，因蛋白质容易热变性，所以很难检测蛋白类肿瘤标志物，另外酶联免疫法的灵敏度较低，而且耗力耗时；电化学对样品的基质要求较高，很难实施；而用仪器检测时成本很高，并且对操作人员的操作技能有很高的要求。

所以，本发明提出了一种新型的、简便的、灵敏的检测方法，把纳米材料作为一种新型探针，进行AFP和Mucin-1的超灵敏检测。

通过 DNA 杂交将20nm粒径的金纳米粒子和20nm粒径的上转换纳米粒子组装成三聚体结构。目标物AFP和其适配体部分互补序列修饰的上转换纳米粒子竞争结合，荧光信号增强；而目标物Mucin-1和其适配体部分互补序列修饰的金纳米粒子竞争结合，拉曼信号减弱。将荧光信号与目标物AFP的浓度建立标准曲线，拉曼信号与目标物Mucin-1的浓度建立标准曲线，以此来定量检测癌症标志物甲胎蛋白及粘蛋白-1。

发明内容

本发明的目的是提供一种金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法及其应用，其提供的新型的、简便的、灵敏的检测方法，把纳米材料作为一种新型探针，进行AFP和Mucin-1的超灵敏检测。

本发明的技术方案，一种金-上转换纳米粒子三聚体的制备方法，具体包括金纳米粒子的合成，上转换纳米粒子的提供，金-上转换纳米粒子三聚体的组装及结构表征，荧光、拉曼信号测试，用金-上转换纳米粒子三聚体检测AFP和Mucin-1。具体步骤如下：

（1）金纳米粒子的合成：进行20nm 粒径金纳米粒子的合成；48.75mL超纯水在搅拌下加入1.25mL 4g/L的氯金酸，使其沸腾，沸腾状态保持2-3min，加入1.2mL 10mg/mL的柠檬酸钠水溶液，观察颜色变化，待颜色不变后冷却至室温，放入冰箱中待用：

（2）上转换纳米粒子的提供：由北京万德高科技发展有限公司购买；

（3）金-上转换纳米粒子三聚体的组装：取两管50mL步骤（1）制备的已浓缩好的 10nM 20nm粒径金纳米粒子，分别与巯基修饰的Mucin-1的适配体及互补序列进行偶联，金纳米粒子︰巯基修饰的Mucin-1的适配体/互补序列的摩尔比为1︰3；再将50mL上转换纳米粒子与巯基修饰的AFP的适配体偶联，其中上转换纳米粒子︰巯基修饰的AFP摩尔比为1︰5；三管试剂均在室温下过夜反应，13000r/min 离心15min，弃上清，然后用50mL的TBE缓冲液分散沉淀，分别得到Au-Mucin-1适配体、Au-互补序列及UCNP- AFP适配体，待用；

将50mL Au-Mucin-1适配体、50mL Au-互补序列和50mL UCNP- AFP适配体杂交反应12h，得到组装产物金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP；离心15min，弃上清，后用100mL的超纯水分散，进行TEM、荧光和拉曼表征。

Mucin-1适配体：5’-GCAGTTGATC CTTTGGATAC CCTGG-SH-3’；

互补序列：5’-GATCAACTGC ACAGCACCAC AGACC-SH-3’；

AFP适配体：5’-SH-GGCAGGAAGA CAAACAGGAC CGGGTTGTGT GGGGTTTTAA GAGCGTCGCC TGTGTGTGGT CTGTGGTGCT GT-3’。

金-上转换纳米粒子三聚体的应用，用于癌症标志物的多重超灵敏检测，具体采用金-上转换纳米粒子三聚体检测甲胎蛋白AFP和粘蛋白-1Mucin-1。

（4）AFP的检测：取100mL的金-上转换纳米粒子三聚体Au-Au-UCNP，加入1mL不同浓度的甲胎蛋白（AFP），使其终浓度在0-100aM（具体为 0、1、2、5、10、20、50、100 aM），反应 10min，进行荧光测试，绘制标准曲线。