[发明专利]一种cfDNA中超低频突变的检测方法

说明书

一种cfDNA中超低频突变的检测方法，其步骤包括文库构建、桥式PCR和测序，文库构建包括末端补平、加A、加接头、PCR扩增，在加接头时，使用1:1的颈环接头和Y字型接头。本发明颈环接头和Y字型接头结合使用，由于Y字型接头上标记有随机序列index，基因组坐标始末位点相同的DNA片段加上完全相同的Y字型接头的概率极低，那么对于始末位点相同的测序reads，就很容易判断它们来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA，从而降低测序duplication。同时颈环接头将DNA片段的正负链连成一条链，二者的测序reads自然配对，提高了对假阳性的分辨率，从而保证了对cfDNA中超低频突变的检测能力。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种cfDNA中超低频突变的检测方法。

背景技术

cfDNA，即cell free DNA，是指游离于细胞外的DNA，存在于循环血浆、尿液和其它体液中，这些DNA是身体细胞和白血球凋亡或坏死时释放出来的，基本都是无害的，而且在人体中的循环半衰期很短。cfDNA在医学领域和生物领域的作用很大，它主要是双链DNA片段，而且绝大多数是短链，在健康人体内通常浓度很低。因为cfDNA的循环半衰期很短，这提示它需要在细胞凋亡或坏死时被持续地释放。在特定的生理条件或疾病过程中，有相当一部分cfDNA会与在健康时的不同，基于这一结果，近年来cfDNA已被用于无创性胎儿染色体异常诊断。在孕妇中，约有10％-15％的cfDNA来自于胎盘滋养层，将cfDNA用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷，是当前无创唐氏筛查的基础！在肿瘤病人中，通过检测cfDNA中来源于凋亡肿瘤细胞的体细胞突变来确定肿瘤的分子分型、负荷和病灶部位等信息已被越来越多的人认可。而在器官移植方面，排斥反应也与供体移植器官中的cfDNA释放水平相关。

cfDNA突变检测具有特异、实时、无创等突出特点，无疑是肿瘤早期筛查、辅助诊断、预后判断及跟踪复发的有效靶标。因此，研究cfDNA突变的检测方法具有很重要的科学意义。

目前的cfDNA文库构建方法，主要步骤包括：末端补平、加A、加接头、PCR扩增。在加接头这一步，DNA片段两端加上相同的Y字型接头，其步骤为：首先提取cfDNA片段，末端补平、加A后为

其中“NNNNNN……NNNNNN”表示互补配对部分。然后合成两条单链DNA片段oligo Ⅰ和oligo Ⅱ，其中oligo Ⅰ为：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’，oligo Ⅱ为：

5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’，其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的；“C*T”中的“*”表示硫代修饰，即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代，“AACGTGAT”是固定序列index(还可以是其他固定序列index)。将oligo Ⅰ和oligo Ⅱ退火即可形成Y字型结构：

oligo Ⅰ的3’端12个碱基和oligo Ⅱ的5’端12个碱基互补配对，oligo Ⅰ的3’端的T突出，以下两条引物可以结合在该接头上进行PCR扩增。

P Ⅰ primer：5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3’，

P Ⅱ Primer：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。