[发明专利]一种cfDNA中超低频突变的检测方法

权利要求书

1.一种cfDNA中超低频突变的检测方法，基于NGS技术，其步骤包括文库构建、桥式PCR扩增和测序，其特征是：所述文库构建过程包括末端补平、加A、加接头、PCR扩增步骤，在加接头步骤中，使用1:1的颈环接头和Y字型接头，所述颈环接头的结构为：其中表示成环序列中的若干个碱基；上下“YYYYY……YYYYY”表示互补配对的序列，其中“Yp”中的“p”表示“Y”是磷酸化修饰的；“Y*T”中的“*”表示硫代修饰，即“Y”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代；“biotin”表示生物素标记；在颈环接头的“3’端”和“5’端”互补配对后，所述碱基“X”为“A”，并且必须碱基之间不能相互配对才能形成颈环。

2.如权利要求1所述的cfDNA中超低频突变的检测方法，其特征是：所述颈环接头中“YYYYY……YYYYY”表示的碱基个数为12个以上；所述成环序列的碱基个数为五个以上。

3.如权利要求2所述的cfDNA中超低频突变的检测方法，其特征是：所述颈环接头中3’端的“YYYYY……YYYYY”为“ACTGGCAGGAAC”，5’端的“YYYYY……YYYYY”为“GTTCCTGCCAGT”。

4.如权利要求3所述的cfDNA中超低频突变的检测方法，其特征是：所述颈环接头由合成单链DNA片段oligo1退火形成，所述单链DNA片段oligo1为：

5’-pGTTCCTGCCAGT-AAAAA-ACTGGCAGGAAC*T-3’；颈环接头的结构为：

5.如权利要求1所述的cfDNA中超低频突变的检测方法，其特征是：所述Y字型接头的结构为：

其中“Gp”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的；“C*T”中的“*”表示硫代修饰，即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代；“NNNNNNNN”为随机序列index，“AACGTGAT”为固定序列index。

6.如权利要求5所述的cfDNA中超低频突变的检测方法，其特征是：所述Y字型接头由两条合成单链DNA片段oligo2和oligo3退火形成，所述单链DNA片段oligo2为：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’；

所述单链DNA片段oligo3为：

5’-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAACGTGATATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’；其中“pG”中的“p”表示“G”是磷酸化修饰的；“C*T”中的“*”表示硫代修饰，即“C”与“T”之间的磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代，“NNNNNNNN”为随机序列index，“AACGTGAT”为固定序列index。