[发明专利]一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物的分子检测技术领域，具体涉及一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒及方法。

背景技术

兰科(Orchidaceae)植物是显花植物中最大且种类最多的家族之一。在自然条件下，兰科菌根真菌(Orchid mycorrhizal fungi，OMF)对大多数陆生兰花的种子萌发以及植株生长是必不可少的。大花蕙兰是由兰科多个种类杂交形成的品种群，也是目前广泛种植的重要盆栽花卉和鲜切花，但较长的营养生长周期限制了其产品质量及经济效益。前期研究表明，OMF瘤菌根菌(Epulorhiza repens)及MAF矮伞形霉(Umbelopsis nana)在瓶内和盆栽条件下单独或者混合接种大花蕙兰组培苗均可以促进其多个品种的营养生长和矿质营养元素吸收。但原接种菌株是否能在盆栽大花蕙兰根部长期定殖和共存并不清楚。由于土壤环境中其它微生物的存在以及混合接种处理等原因，常规的菌根整体染色、菌株重分离和石蜡切片等技术手段都不再适用于盆栽条件下对目标接种真菌菌株的检测。因此建立一种快速、准确有效且灵敏度高的检测方法是非常有必要的。

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。若第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此巢氏PCR技术具有很高的特异性。目前此项技术在鉴定和检测各种微生物的研究上应用极为广泛。

但目前尚未有通过巢式PCR检测大花蕙兰菌根真菌瘤菌根菌和/或其伴生真菌矮伞形霉的研究与报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的方法，是采用上述试剂盒实现的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒，包含用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对和用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对；

用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：

正向外引物M6F：5'-ACGACGATGAAGATGTGATG-3'；

反向外引物M6R：5'-GGAGGTGATACAGTGGGTG-3'；

正向内引物M6CF：5'-ATGAAGATGTGATGAGAAGCA-3'；

反向内引物M6CR：5'-ATTGGGATAAGGCAGAAGTAG-3'；

用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：

正向外引物Z3F：5'-TCCTCCTCGTCCTGATTCCG-3'；

反向外引物Z3R：5'-ATGTTTTCCCACCAGTAGCC-3'；

正向内引物Z3CF：5'-TCAAGTCATTCCCGAACACAA-3；

反向内引物Z3CR：5'-GTAGACAAACCAGGAGCCAGC-3'。

所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒，还包括酶、PCR反应缓冲液和PCR反应用水中的至少一种。

一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组DNA；

(2)用上述试剂盒进行检测：先以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以正向外引物和反向外引物为引物对进行第一次PCR扩增，得到的PCR产物；再以此PCR产物为模板，以正向内引物和反向内引物为引物对进行第二次PCR扩增，得到的PCR产物进行凝胶电泳；

(3)结果判断：第一次PCR的引物对为正向外引物M6F和反向外引物M6R，第二次PCR的引物对为正向内引物M6CF和反向内引物M6CR，扩增得到435bp条带，表明待检测样品中存在瘤菌根菌；第一次PCR的引物对为正向外引物Z3F和反向外引物Z3R，第二次PCR的引物对为正向内引物Z3CF和反向内引物Z3CR，扩增得到195bp条带，表明待检测样品中存在矮伞形霉。

所述的待检测样品为各种栽培条件下的大花蕙兰根部、培养大花蕙兰的土壤或菌株样品。