[发明专利]一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的试剂盒，其特征在于：包含用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对和用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对；

用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：

正向外引物M6F：5'-ACGACGATGAAGATGTGATG-3'；

反向外引物M6R：5'-GGAGGTGATACAGTGGGTG-3'；

正向内引物M6CF：5'-ATGAAGATGTGATGAGAAGCA-3'；

反向内引物M6CR：5'-ATTGGGATAAGGCAGAAGTAG-3'；

用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：

正向外引物Z3F：5'-TCCTCCTCGTCCTGATTCCG-3'；

反向外引物Z3R：5'-ATGTTTTCCCACCAGTAGCC-3'；

正向内引物Z3CF：5'-TCAAGTCATTCCCGAACACAA-3；

反向内引物Z3CR：5'-GTAGACAAACCAGGAGCCAGC-3'。

2.根据权利要求1所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的试剂盒，其特征在于：还包括酶、PCR反应缓冲液和PCR反应用水中的至少一种。

3.一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组DNA；

(2)用权利要求1或2所述的试剂盒进行检测：先以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以正向外引物和反向外引物为引物对进行第一次PCR扩增，得到PCR产物；再以此PCR产物为模板，以正向内引物和反向内引物为引物对进行第二次PCR扩增，得到的PCR产物进行凝胶电泳；

(3)结果判断：第一次PCR的引物对为正向外引物M6F和反向外引物M6R，第二次PCR的引物对为正向内引物M6CF和反向内引物M6CR，扩增得到435bp条带，表明待检测样品中存在瘤菌根菌；第一次PCR的引物对为正向外引物Z3F和反向外引物Z3R，第二次PCR的引物对为正向内引物Z3CF和反向内引物Z3CR，扩增得到195bp条带，表明待检测样品中存在矮伞形霉。

4.根据权利要求3所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于：所述的待检测样品为各种栽培条件下的大花蕙兰根部、培养大花蕙兰的土壤或菌株样品。

5.根据权利要求3所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于：步骤(2)中所述第一次PCR扩增的体系为：2×Taq PCR Premix 10μL，浓度为10μmol/L的正向外引物和浓度为10μmol/L的反向外引物各1μL，基因组DNA 200ng，ddH₂O补足至20μL。

6.根据权利要求3所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于：步骤(2)中所述第一次PCR扩增的反应条件为：预变性94～95℃5min；变性94℃30s、退火55～60℃20～45s、延伸72℃1min～2min，30个循环；终延伸72℃10min。

7.根据权利要求6所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于：所述的预变性的温度为94℃；

所述的退火的条件为56～57℃退火30s；

所述的延伸的时间为1min 30s。

8.根据权利要求3所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于：步骤(2)中所述第二次PCR扩增的体系为：2×Taq PCR Premix 10μL，浓度为10μmol/L的正向内引物和浓度为10μmol/L的反向内引物各1μL，第一次PCR扩增得到的PCR产物稀释20～1000倍1μL，ddH₂O补足至20μL。

9.根据权利要求3所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于：所述第二次PCR扩增的反应条件为：预变性94～95℃5min；变性94℃30s、退火56～64℃20～45s、延伸72℃1min～2min，运行15个循环；终延伸72℃10min。

10.根据权利要求9所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和矮伞形霉的方法，其特征在于：所述的预变性的温度为94℃；

所述退火的温度为56～60℃；

所述的退火的时间为30s；

所述的延伸的时间为1min 30s。