[发明专利]一种利用流体动力色谱同时分离检测多组microRNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，属于生物化学领域。该方法主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测和microRNA相关药物研究以及筛选。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类长度为19～25个核苷酸(nt)的单链RNA序列，该序列具有内源性，不编码蛋白质，且高度保守。miRNA可与蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体。游离在细胞质和细胞核的miRNA,当其与目标mRNA完全互补配对时，会造成mRNA降解，当其与目标mRNA不完全互补配对时，会抑制mRNA翻译蛋白质，通过这种特殊作用，来实现基因表达调控的作用。已有研究证明，miRNA在动物、植物和真菌中的表达存在明显的差异性，从而影响细胞生长和发育过程。近年来，科学家已发现人体中存在的miRNA有2千多种，约占人类基因组的1％，但却参与调控约30％基因的表达。miRNA不仅影响人体内的细胞增殖、分化、发育、凋亡等生理过程，而且与人类心脏病、癌症、神经性疾病等密切相关。

目前，已经报道多种方法检测miRNA。传统的检测手段包括三种，第一种是Northern Bloting法，这种方法被认为是最经典的检测方法，但是该方法要求样品量多，特异性低，分析时间长，灵敏度低且不可区分序列差别少的miRNA。第二种是Microarray技术，该方法灵敏度和特异性有所提高，所需样品量也有所减少，但是Microarray技术的分析时间较长，灵敏性和特异性仍有待提高。第三种RT-PCR技术常被用来进行miRNA的定量分析，检测灵敏度得到大幅度提高，可以实现单分子高通量检测，但是RT-PCR技术分析链长较短的miRNA会使得实验设计非常复杂，理想的扩增技术也需要非常精确的循环温度控制。近期报道了一些检测miRNA的新方法，例如基于生物发光的检测、基于纳米颗粒的检测、基于酶方法的检测、基于修饰引物入侵法的检测、基于核酸序列的检测等。

毛细管流体动力色谱法是一种基于流体动力学的分离方法，即在窄内径、未经修饰的毛细管内达到多种样品分离的方法，该方法以低样品量、高选择性、高灵敏度、分析时间短、检测成本低等优点在分离聚合物颗粒、胶体颗粒和蛋白等得到广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种同时分离检测多组microRNA的方法。该方法灵敏度高、特异性强、分析时间短、检测成本低。

本发明是将毛细管流体动力色谱法引入到分子生物分析检测领域，首次利用流体动力色谱法分离检测多组microRNA。

本发明采用如下技术方案：

一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，包括以下步骤：

1)确定几组待分离检测的microRNA，设计与其互补的ssDNA；

其中假设几组待分离检测的microRNA依次为microRNA-1、microRNA-2、以此类推直到microRNA-n，则与microRNA-1、microRNA-2……microRNA-n互补的ssDNA以此为ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n；

ssDNA-1完全与microRNA-1互补，不添加其他碱基；ssDNA-2除了完全与microRNA-2互补的序列之外，另添加一定长度的碱基序列；ssDNA-3完全与microRNA-3互补的序列之外，还添加了相对ssDNA-2具有一定长度的的碱基序列，以此类推，ssDNA-n相对ssDNA-n-1增加有一定长度的碱基序列，在ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n中增加的碱基序列可以相同也可以不同，但ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n均不互相杂交缠绕；以此类推，ssDNA-n总是比ssDNA-n-1多出一定数量的碱基，构成分离标签；

ssDNA-n总是比ssDNA-n-1多出至少10个碱基；

2)设计好的ssDNA分别与microRNA杂交，杂交条件：95℃变性5min，温度降至42℃退火25min；杂交后得到杂交双链；杂交后加入核酸荧光染料，反应10min；

3)杂交后加入核酸荧光染料的体系在高纯氮气(如不低于99.9％)低压下进样，在未经任何修饰的裸微纳毛细管内分离；分离后，在毛细管尾端进行激光诱导荧光检测器定量。

优选的是，设计的ssDNA自身不会杂交缠绕，不会形成发卡或者其他结构，结构最小自由能为零，具有相当稳定的单链结构且与人体中已发现的基因组保持最小相似度，相关检测干扰达到最低。