[发明专利]一种利用流体动力色谱同时分离检测多组microRNA的方法

权利要求书

1.一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)确定几组待分离检测的microRNA，设计与其互补的ssDNA；

其中假设几组待分离检测的microRNA依次为microRNA-1、microRNA-2、以此类推直到microRNA-n，则与microRNA-1、microRNA-2……microRNA-n互补的ssDNA以此为ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n；

ssDNA-1完全与microRNA-1互补，不添加其他碱基；ssDNA-2除了完全与microRNA-2互补的序列之外，另添加一定长度的碱基序列；ssDNA-3完全与microRNA-3互补的序列之外，还添加了相对ssDNA-2具有一定长度的的碱基序列，以此类推，ssDNA-n相对ssDNA-n-1增加有一定长度的碱基序列，在ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n中增加的碱基序列可以相同也可以不同，但ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n均不互相杂交缠绕；以此类推，ssDNA-n总是比ssDNA-n-1多出一定数量的碱基，构成分离标签；

2)设计好的ssDNA分别与microRNA杂交，杂交条件：95℃变性5min，温度降至42℃退火25min；杂交后得到杂交双链；杂交后加入核酸荧光染料，反应10min；

3)杂交后加入核酸荧光染料的体系在高纯氮气低压下进样，在未经任何修饰的裸微纳毛细管内分离；分离后，在毛细管尾端进行激光诱导荧光检测器定量；

ssDNA-n比ssDNA-n-1多出至少10个碱基。

2.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，杂交时，microRNA溶于DEPC处理水中，ssDNA溶于1×TE，两互补杂交单链摩尔比1:1。

3.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，所述微纳毛细管内径在400-1100nm之间，总长度40-70cm，有效长度35-65cm。

4.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，所用缓冲溶液1×TE溶液，pH7.5-8.5。

5.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，所述核酸荧光染料为具有结合在双链之间后发出荧光的核酸染料。

6.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，所述核酸荧光染料为YoYo-1。

7.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，步骤3)进样时低压控制在20-300psi，进样时间控制在5-60s，分离时高压控制在700-1600psi。

8.按照权利要求1所述的一种利用流体动力色谱分离检测多组microRNA的方法，其特征在于，激光功率采用10-50mW，光电倍增器采用200-700mV。