[发明专利]一种基于胶体金探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品分析技术领域，涉及食物过敏原及其致敏性残基含量的高灵敏检测方法。

背景技术

牛乳具有丰富的营养物质，也经常添加到其他食品中，是人们日常生活中经常摄入的物质，同时牛乳作为八大类过敏食物之一，牛乳过敏在人群中的发病率为0.3%～7.5%，而在儿童中的发病率达0.1～7.5%，其中在一岁以下的婴幼儿中的发病率达到2%～3%。食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission）、欧洲食品标签指导委员会（European Food Labeling Directive）和美国食品药品管理局（FDA）都规定食品标签中必须列出各类致敏成分，其中就包括牛乳及乳制品。对食物过敏原的检测是食物过敏管理的关键环节，以便对过敏食物进行风险评估、生产和标示。牛乳中过敏原成分复杂，其中β-乳球蛋白约占牛乳蛋白含量的10%，约占乳清蛋白总量的50%，且IgE介导的牛奶过敏中82%的病人对β-乳球蛋白过敏。因此，开展β-乳球蛋白的检测，是保护牛乳过敏人群合法权益的关键举措，也有利于生产低致敏食品，从而提高牛乳过敏患者的生活质量。

目前，食物过敏原的检测技术有基于蛋白检测的免疫学技术、高效液相色谱技术、液相/质谱联用技术等，及基于核酸检测的聚合酶链式反应技术等，其中免疫学技术最成熟、最常用。抗体在免疫学方法检测食物过敏原中起着关键作用。抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，其中单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌，抗体具有高特异性、均一性特点。虽然多克隆抗体具有制备简单、经济，但相对于单克隆抗体，多克隆抗体的特异性和均一性较差，且产量有限。

蛋白质的结构决定其功能，作为食物过敏原的蛋白，过敏原表位是引起过敏反应的物质基础，包括线性表位和构象性表位。食品在加工及工业应用中常常会经过加热、发酵、酶解等处理，这使过敏原构象性表位易被破坏，但线性表位则相对稳定，不易被破坏。合成牛乳β-乳球蛋白主要IgE线性表位肽，通过杂交瘤技术制备特异性识别该表位肽的单克隆抗体。

由于金属纳米颗粒具有比表面积大、易与抗体偶联等特点，被广泛应用于高灵敏检测方法中。目前，应用较多的纳米金属有胶体金、纳米银、免疫磁珠等，而胶体金是应用最广泛的纳米材料。另外， KOH可以羟基化修饰酶标板，可以进一步共价结合抗体，缩短包被时间，提高检测效率。因此，对酶标板进行羟基化修饰，并共价固定单克隆抗体，利用β-乳球蛋白多克隆抗体与胶体金制备胶体金探针，并建立基于胶体金探针的酶联免疫吸附法（ELISA）进行高灵敏、高效率地检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量，同时可评价食物样品致敏性的强弱，评估食品安全风险的高低，也为食品过敏原标示提供更可靠的检测方法。目前，在我国，结合共价固定抗体的高效率、胶体金的高灵敏和IgE表位单克隆抗体的特异性对食品中过敏原及其致敏性残基的定量检测还是空白。

发明内容

本发明的主要目的在于提出一种基于胶体金探针检测牛乳β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法，建立一种基于胶体金探针高灵敏的IgE线性表位识别检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法。该方法准确性高、灵敏度高、特异性好、回收率高、检测时间短。

本发明的技术方案如下。

1、β-乳球蛋白IgE线性表位单克隆抗体的制备。

合成文献报道的β-乳球蛋白主要IgE线性表位AA127-144（EVDDEALEKFDKALKALP），并在其N端加上一个半胱氨酸（C），然后与血蓝蛋白偶联制备免疫原。以制备的免疫原免疫 BALB/c 小鼠，采用腹部皮下多点注射方式免疫，利用细胞融合技术将脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得可分泌抗体的细胞株，通过筛选得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并借助小鼠体内诱生腹水法大量制备抗体，最后用Protein G亲和柱纯化的得到β-乳球蛋白IgE线性表位单克隆抗体。

2、β-乳球蛋白多克隆抗体的制备。

以牛乳β-乳球蛋白为抗原，通过常规方法制备获得β-乳球蛋白多克隆抗体。

3、抗体的纯化。

把β-乳球蛋白与CNBr-Sepharose 4B柱材偶联，制备免疫亲和柱。兔抗β-乳球蛋白抗血清与等体积PBS混合，将血清加入Sepharose 4B亲和柱中，室温下孵育30 min，再循环上样一次；用20倍柱体积的PBS进行非特异性洗脱，再用10倍柱体积的3 M MgCl₂进行特异性洗脱得到牛乳β-乳球蛋白特异性多克隆抗体。纯化后，用截留分子量为3 kDa的超滤管对抗体进行除盐，并浓缩至合适的体积。