[发明专利]一种基于胶体金探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法

权利要求书

1.一种基于胶体金探针检测牛乳β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法，其特征是按以下步骤：

（1）合成β-乳球蛋白主要IgE线性表位AA127-144，并在其N端加上一个半胱氨酸，然后与血蓝蛋白偶联制备免疫原；以免疫原为抗原，制备识别该表位的单克隆抗体；

（2）以β-乳球蛋白为抗原，制备β-乳球蛋白多克隆抗体；

（3）把β-乳球蛋白与CNBr-Sepharose 4B柱材偶联，制备免疫亲和柱；用制备的免疫亲和柱，纯化抗血清中的β-乳球蛋白多克隆抗体；

（4）把纯化得到的β-乳球蛋白多克隆抗体与生物素按1:20的摩尔比混合，冰浴2 h，用脱盐柱除去多余的生物素；

（5）取1 mL粒径为20 nm的胶体金溶液，再加40 μL 浓度为1mg/mL的生物素化β-乳球蛋白多克隆抗体，25 ℃偶联1 h；然后加100 μL 10%的BSA，25 ℃孵育1 h，封闭胶体金表面未结合抗体的位点；接着用低温离心机14000g 4℃离心30 min，去除未结合的游离抗体，加入1 mL保存液，重悬标记抗体的胶体金探针沉淀，保存液为含1% BSA，1 % PEG 20000，5%蔗糖，0.25% Tween-20，pH 6.5的PBS；

（6）聚苯乙烯酶标板中每孔加入200 μL 1%的KOH，37 ℃孵育5 min进行羟基化修饰，再用超纯水洗5次；用pH 为4.7，浓度为0.1 M的MES把EDC配成浓度为4 mg/mL ，加10 μL EDC到990 μL浓度为8 μg/mL的单克隆抗体中，37 ℃孵育5-10 min活化抗体；活化的抗体与等体积的4% APTES混合，然后加100 μL抗体到羟基修饰的酶标板中，37 ℃孵育1 h，再用PBST清洗3次；

（7）往共价固定有单克隆抗体的酶标板中每孔加入250 μL 含2%明胶的PBST溶液，37 ℃封阻1 h；清洗后，每孔加入100 μL已知浓度梯度的β-乳球蛋白，37 ℃孵育1.5 h；清洗后，每孔加入100 μL胶体金探针，37 ℃孵育1.5 h；清洗后，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37 ℃孵育1.5 h；清洗后，每孔加入100 μL TMB溶液，于37 ℃避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M 的H₂SO₄终止反应，然后用酶标仪测吸光值，根据吸光值和抗原浓度的关系绘制β-乳球蛋白标准曲线；

（8）将所需检测的食品进行提蛋白，离心除脂肪/沉淀处理，制备检测样；根据上述方法共价固定抗体、封闭清洗后，每孔加入预处理的样品，孵育清洗后，按步骤7依次加入胶体金探针、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、TMB溶液，经H₂SO₄终止反应后，用酶标仪检测吸光值，把吸光值带入标准曲线计算出被检样品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量。