[发明专利]一种胰高血糖素的纯化方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种胰高血糖素的纯化方法。本发明所述纯化方法将胰高血糖素粗肽溶解后，调节粗肽溶液的pH至碱性，往粗肽溶液中加入蛋白变性剂和氯化物盐反应至胰高血糖素含量不再增加，然后降温进行RP‑HPLC纯化和转盐。本发明发现了制约胰高血糖素粗肽纯化效率低下的关键因素，进而据此发现采用蛋白变性剂和氯化物盐对粗肽预处理，而后进行纯化，由此可将纯化收率和总收率大幅提高。在此基础上可进一步以复合盐溶液为流动相进行纯化，能够提高胰高血糖素的品质。在胰高血糖素现有纯化工艺中，本发明纯化方法优势明显，收率和品质提高明显，带来的经济效益也非常可观。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胰高血糖素的纯化方法。

背景技术

胰高血糖素(升糖素)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，由29个氨基酸组成直链多肽，分子量为3485道尔顿。胰高血糖素肽序如下：

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH

胰高血糖素通过与体内受体结合，通过糖原分解而释放肝脏中以糖原形式贮存的葡萄糖，从而帮助维持血液中的葡萄糖水平可以升高血糖，其半衰期较短。现有文献表明，胰高血糖素在体内的能量代谢或者是能量摄取调解中起重要的作用[Habegger等,NatureReviews Endocrinology 2010，6，689-697]，所以胰高血糖素在代谢疾病方面或许同样扮演重要的角色，比如在心血管、肥胖、糖尿病等等。另外胰高血糖素可用于注射胰岛素过量引起的低血糖昏迷及心源性休克、充血性心功能不全，心肌梗死及心脏手术后的急性心功能不全。鉴于全球糖尿病、肥胖和心血管疾病人数的急速增长，在代谢疾病中的应用，前景明朗，特别是在注射胰岛素治疗糖尿中配合使用，预计到2030年，全球将有5亿人罹患糖尿病，所以胰高血糖素仅在降血糖药物引起急速低血糖治疗中，市场前景广阔。

现有胰高血糖素主要是通过生物发酵方式获取的，市场销售主要有诺和诺德和礼来。生物发酵方式受表达量限制，收率低，并且纯度也较低。通过化学合成方式文献也较少，现有如专利CN 103333239，主要是化学合成和制备工艺均比较困难，胰高血糖素肽链较长，肽序中含有较多的Asp，合成过程中容易形成内酰胺及相应的异构化杂质，另外，肽序中还含Ser、His等合成过程中易异构化的氨基酸而导致粗肽中具有异构体杂质；同时肽序中含有Gln和Asn，精肽极其不稳定，易发生水解，主要是其三个谷氨酰胺水解杂质和一个天冬酰胺水解杂质(美国药典)。US专利(20080160072)表明胰高血糖素在pH大于9.5或者小于3时溶解性较好，并且在胰高血糖素溶于水后，其稳定性也较差，稳定性与其成盐方式、盐浓度、pH和温度均有影响(Beaven等，European J.Biochem.1969,11,37-42)。因此，通过化学合成方式总收率较低，产量较低，进而需多次合成纯化，经济成本和环境成本均较高。

随着反相高效液相色谱(RP-HPLC)技术的成熟，其被应用到胰高血糖素目前常用的纯化中。尽管选择不同厂家填料的筛选、不同的缓冲盐、不同盐浓度和pH筛选，均可以将胰高血糖素纯度控制在较高水平(纯度在97％以上，单个杂质小于1％)，但是通过改变条件并组合优化时，纯化总收率并没有明显提高。即使通过合成工艺优化去除杂质进而试图提高后面纯化的收率，也无实现纯化后收率的大幅提高。这些现象一直制约着胰高血糖素无法达到较高生产效率，如何能够突破当下纯化工艺的技术瓶颈，一直是技术人员不断探索的目标。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胰高血糖素的纯化方法，使得所述纯化方法能够显著提高胰高血糖素的纯化收率和总收率。

本发明的另一个目的在于提供一种胰高血糖素的纯化方法，使得所述纯化方法能够提高胰高血糖素的纯度大于99％且单个杂质均小于0.15％。