[发明专利]一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属免疫学及肿瘤治疗学技术领域，涉应用基因工程技术在体外制备CD8+T记忆性干细胞的方法，具体涉及一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(T cell Receptor-T memory stem cell，CD8+TCR-Tscm)的制备方法及其用途；尤其是可识别多种肿瘤特异性抗原的TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(TCR-Tscm)的体外制备方法及其在用于制备防治肿瘤制剂中的用途。

背景技术

现有技术公开了恶性肿瘤属系统性疾病，是人体正常器官组织细胞在各种致病因素的作用下发生恶性改变，逃避免疫监视，打破免疫均衡，产生了免疫耐受，继而呈无限制生长的新生物。鉴于恶性肿瘤作为一种内源性疾病，手术、化疗、放疗及分子靶向治疗等外在干预性治疗措施还存在一定的局限性。随着肿瘤免疫学及分子生物学等学科的发展，通过调动或激发机体自身的免疫功能，从而抑制和杀伤肿瘤细胞的免疫治疗成为肿瘤治疗新的热点。

自上世纪80年代以来，过继性细胞免疫治疗(Adoptive Cell Transfer,ACT)包括淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer,LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)等已先后应用于临床，但由于细胞回输后在体内活性持续较短、缺乏肿瘤特异性及疗效不确切等诸多问题，其在临床应用中受到限制。

有研究报道了新一代具有肿瘤抗原特异性的TCR基因修饰的T细胞(TCR-T)和嵌合型抗原受体细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)能克服传统细胞治疗缺乏特异性的弊端，推动了以免疫细胞为基础的精准靶向免疫治疗的发展。研究显示，CAR的基本结构包括肿瘤相关抗原识别区域(如scFv)、配合基或肽、铰链区等细胞外区域、跨膜区域以及包含一个或多个信号分子的细胞内信号区域。CAR-T细胞是将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体(scFv)和T细胞的活化序列在体外进行基因重组，形成重组质粒，通过转染技术，在体外转染，纯化和大规模扩增经过基因改造和修饰后的T细胞；CAR-T在体外及体内均有显现对特定肿瘤抗原具有高度亲和性，CAR-T在体内能够迅速扩增，及对抗原负荷肿瘤细胞具有高效选择性杀伤作用，等。

目前有诸多机构在进行有关CAR-T疗法的研究，但尚无统一标准，尤其其中在CAR设计、培养技术、淋巴细胞去除方法以及所干预的疾病等存在不同。研究显示，“第一代”CAR-T虽能够特异性地靶向抗原，但没有共刺激分子，临床活性不高且在机体内的存在短暂；“第二代”CAR-T细胞加入了共刺激分子，如CD28、或CD137(4-1BB等),如美国国家癌症研究院(NCI)使用的是靶向CD19含CD28共刺激域的第二代CAR，且通过逆转录病毒进行基因转导，治疗的疾病是非霍奇金淋巴瘤，而宾夕法尼亚大学研究使用的是加入4-1BB共刺激分子的CAR，治疗的疾病是ALL和CLL；“第三代”CAR-T细胞又多加入一个共刺激分子，例如CD28+4-1BB或CD28+OX40，等等。

近年来肿瘤靶向治疗研究的热点之一是嵌合型抗原受体(CAR,chimeric antigen receptor)修饰的T细胞能够被赋予特异的肿瘤抗原识别能力,并能够引发特异的肿瘤杀伤活性。目前,有针对多种肿瘤的CAR-T细胞在临床试验并取得疗效，该免疫疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者的临床试验显现示出非常振奋人心的结果，如，在接受了CTL019输注(靶向CD19抗原的CAR-T疗法)的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月90％患者获得完全缓解，其中甚至包括15位已经接受过干细胞移植的患者，6个月时无事件生存率为67％(20人)，总体生存率为78％(23人)，另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓解。