[发明专利]一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的制备方法及其用途

权利要求书

1.一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的体外制备方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)将合成的肿瘤特异性抗原肽与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；

(2)将步骤(1)获得的成熟树突状细胞与CD8+初始T细胞共培养，并加入干细胞分化抑制剂促进、产生肿瘤抗原特异性的特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；

(3)分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；

(4)从分离获得的特异性识别表达特定肿瘤抗原的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞中克隆特异识别特定抗原表位的T细胞受体(TCR)基因α链和β链；

(5)用步骤(4)获得的识别特定抗原表位的TCR基因α链和β链，构建识别不同肿瘤特定抗原的TCR基因，通过慢病毒包装或逆转录病毒载体转染自体的CD8+Tscm细胞，体外制备不同肿瘤特定抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞；

(6)用CRISPR/Cas9基因敲除步骤(5)制备的抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞一个或多个抑制性受体基因。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原为人工合成的特异性肿瘤抗原表位肽或者佐剂重组人钙网蛋白复合物；所述的肿瘤特异性抗原肽选自：NY-ESO-1,AFP,CEA,CA-125,MUC-1,ETA,MAGE,突变的Ras、Raf及突变的p53,以及肿瘤特异性突变抗原，如EGFR点突变T790M,G719X,L858R和缺失性突变。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原由肿瘤细胞在免疫原性细胞死亡诱导剂作用下释放。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的未成熟的树突状细胞通过单个核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的作用下诱导形成。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育时，同时加入肿瘤坏死因子α。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，从悬浮的单个核细胞分选出所述的CD8+初始T细胞。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞分化抑制剂是mTOR抑制剂、白介素-7、白介素-15或者其组合。

8.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原特异性CD8+T记忆性干细胞具有CD45RA+CD45RO-CCR7+ CD62L+CD95+IL-2Rβ+的标记特征。

9.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，根据肿瘤表达特异性抗原的不同共转染效应的2个或2个以上TCR基因。

10.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述的抑制性受体基因包括PD-1，CTLA4，TIM3，B7-1,BTLA,VISTA,LAG-3。

11.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的免疫原性细胞死亡诱导剂是8％玫瑰红、甲胺喋呤、阿霉素或者奥沙利铂中的一种或者几种。

12.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞源自经处理后产生免疫原性细胞死亡的病人自体肿瘤组织细胞。

13.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞为血液系统肿瘤、实体瘤细胞、胸腹水脱落肿瘤细胞,或者对应的肿瘤干细胞。

14.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单个核细胞来源于肿瘤患者或健康者离体细胞或者脐带血。

15.按权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的mTOR抑制剂是雷帕霉素或依维莫司。

16.权利要求1的方法制得的特定抗原特异性的CD8+ TCR-Tscm细胞在用于制备抗肿瘤药剂中的应用。

17.权利要求1的方法制得的TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞在用于制备肿瘤检测试剂盒中的应用。