[发明专利]一种增强型CIK细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体地说是一种增强型CIK细胞的培养方法。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，可用于任何一期的肿瘤患者，是一种广泛应用的肿瘤免疫治疗手段。这种细胞对肿瘤细胞的精确识别杀伤能力很强(不损伤正常的细胞)，尤其对手术后或放化疗后的患者治疗效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止肿瘤细胞扩散和复发，并能提高机体免疫力。CIK细胞能通过体外诱导而得以扩增，常规的CIK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用含有IFN-γ的培养液预处理后，再加入CD3mAb(CD3单克隆抗体)、IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞。但最终获得的CIK细胞的增殖倍数和细胞毒活性都不是很理想。同时，所用的培养液主要利用胎牛血清或者小牛血清作为细胞培养的营养物，虽然有足够的供应量、价格便宜，但是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，给CIK临床治疗埋下安全隐患，并且动物血清并不能很好的支持CIK免疫细胞的生长。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述背景技术存在的不足提供一种增强型CIK细胞的培养方法，该方法培养得到的CIK细胞能保证良好的增殖率，而且细胞毒活性高、杀伤活性高。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种增强型CIK细胞的培养方法，其步骤包括：

(1)提取并分离单个核细胞；

(2)将单个核细胞用培养液进行诱导培养，并加入细胞因子得到诱导液，诱导液中细胞密度为(2-8)×10⁶个/ml；

(3)每隔3-5天向诱导液中补充培养液和细胞因子，使诱导液中细胞密度维持在(1-4)×10⁶个/ml；

(4)7-21天后收集CIK细胞。

优选的，所述步骤(2)中按照50-2000U/ml加入细胞因子IFN-γ进行预处理。

优选的，所述预处理后间隔16-36小时，再向培养液中添加细胞因子CD3mAb、IL-1α和IL-2进行诱导培养，其中CD3mAb的添加量为10-100ng/ml，IL-1α的添加量为50-2000U/ml，IL-2的添加量为100-2000U/ml。

更优选的，进行诱导培养时，还添加有细胞因子IL-15，其添加量为100-2000U/ml。优选为500-1000U/ml。

优选的，所述步骤(3)中，补充的细胞因子为IL-2和IL-15，所述IL-2的添加量为100-2000U/ml，所述IL-15的添加量为100-2000U/ml的IL-15。

优选的，所述培养液包括基础培养液和营养物质，其中营养物质由自体血清、人血白蛋白和三磷酸腺苷组成；所述营养物质中，自体血清占培养液的体积百分数为5-10％，人血白蛋白占培养液的体积百分数为5-10％，三磷酸腺苷的浓度为10-1000U/ml；所述基础培养液为GT-T551无血清培养基。

本发明的增强型CIK细胞的培养方法除了按照常规培养方法进行之外，还在诱导培养时，以及每隔3-5天均加入了细胞因子IL-15，IL-15与IL-2和培养液协同效应，使本发明方法培养7-21天后得到的CIK细胞中有效细胞含量(即CD3⁺CD56⁺的表达量)是传统CIK细胞的两倍以上，并且杀伤活性较传统CIK提高可达20％。同时，在基础培养液的基础上，采用自体血清、人血白蛋白和三磷酸腺苷作为营养物质，避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏原污染几率。一方面三磷酸腺苷在水解时，给细胞提供生长能量，另一方面自体血清中含有大量细胞生长需要的营养物质，而且可以提供游离的铁离子，与三磷酸腺苷一起协同调节CIK细胞的增殖效率。而白蛋白可以保持CIK细胞的活性，提高培养细胞的存活率，适合临床治疗应用。本发明方法简单，成本低，具有很强的实用性。

附图说明

图1为本发明CIK细胞抗体表达的流式细胞检测图；

图2为对照组CIK细胞抗体表达的流式细胞检测图。

具体实施方式