[发明专利]一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及检测苯丙酮尿症致病基因是否发生突变的试剂盒。

背景技术

现有技术公开了苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU)是一种遗传代谢病，由挪威的Folling医生于1934年发现，因患者尿液中含有大量的苯丙酮酸而得名。研究显示该疾患是由于体内苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性降低或其辅酶四氢生物喋吟缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，血液和组织中苯丙氨酸浓度增高，尿中苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加，称为“苯丙酮尿症”。调查显示该疾患虽为遗传代谢病，但并不少见，我国PKU患病率约为1:10000，美国约为1:14000，北爱尔兰约为1/4400，德国约为1:7000，日本约为1:784000。

目前PKU分为两种类型：经典型PKU和BH4缺乏型PKU；其中经典型PKU占99％，是由于染色体基因突变导致肝脏中PAH缺陷而引起苯丙氨酸代谢障碍所致。

研究报道了人类PAH基因定位于染色体12q22-24.1全长约90Kb，成熟mRNA长约2.4Kb，共有13个外显子和12个内含子，编码由451个氨基酸组成的酶单体。迄今，在PAH基因上发现了大约567个致病突变(http://www.pahdb.mcgill.ca/cgi-bin/pahdb)，其中点突变在85％以上，有研究在中国人群中发现44种PAH的致病突变类型；其中PAH基因突变导致PAH相应氨基酸的改变，形成不稳定的PAH酶蛋白或降低酶的活性；或甚至突变成终止密码子，导致PAH酶的缺失。研究显示，PAH基因突变具有以下特点：(1)突变位置多变：所有外显子、内含子，5^/-UTR和3^/-UTR区均发现突变，突变不能单从CpG位点解释；(2)突变类型多样：有错义突变、小缺失、剪接位点突变等，但大部分是错义突变；(3)突变呈现明显的异质性：不同种族和地区人群之间PAH基因座突变部位及分布具有较大差异。还有研究显示，PKU是单基因突变且大部分是复合杂合子，因此大部分PAH基因必然有两个等位基因突变。

目前，本领域学者在致力寻找PAH的高频突变等位基因，以探索PKU的基因诊断、产前诊断及携带者检查，如，Guldberg 1996年研究美国PKU患者发现高频突变等位基因为R408W(18.7％)；波兰PKU基因突变高频位点为A403G和R297H；Yoshiyuki研究41例日本PKU，发现高频突变位点为R413P和R243Q。Johannes检测546例PKU，其中411例德国人，65例土耳其人，发现91种突变，最常见的突变是R408W(22％)，并指出欧洲PAH基因突变有明显地区差异，如南欧常见突变为IVS10-11G>A东欧为R408W、(巴厘岛占80％以上)、北欧为IVS12+1G>A(丹麦占37％)或R408W(爱尔兰占42％)。Judith检测西班牙115例PKU和268名亲属，发现57种不同类型的突变。还有临床表型和基因型研究报道R408W纯合子是经典型PKU，R261Q纯合子是中间型PKU；R408W复合杂合子表型取决于其他等位基因的突变类型，R408W/IVSnt-1，R408/R261X表现为经典型PKU，R408W/R252W表现为轻型PKU，R408W亦可见于良性高苯丙氨酸血症；Desviat检测古巴的28例PKU病人，发现古巴PKU患者的突变热点为E208K和R261Q；Giannattasio检测分析意大利PKU患者的289条染色体，发现基因突变具有地区差异，IVS10nt-11G>A和R261Q是意大利PKU患者的突变热点。

目前国内外对苯丙酮尿症患儿的诊断方法主要有尿三氯化铁试验、血清苯丙氨酸浓度测定、尿蝶呤分析、Guthrie细菌抑制试验。实践显示，所述生化检测的方法耗时长且繁琐，而且仅适用与已经出生的婴儿，对产前诊断无能为力。尤其对已生育过苯丙酮尿症患儿的家庭，再次怀孕生育苯丙酮尿症患儿的概率为25％，盲目生育导致悲剧发生的可能性极大。业内共识，由于苯丙酮尿症的致病基因(苯丙氨酸羟化酶基因)仅在肝脏和肾脏中表达，基因诊断成为早期诊断的最有效的手段。有关研究开始对PKU患者的筛查和临床检验，如单链多态性PCR检测(PCR-SSCP)、等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO)、限制性内切酶的酶切(PCR-RFLP)、等位基因特异性扩增(ARMS)、短串联重复序列(PCR-STR)及高压液相色谱定量(HPLC)法且已经应用于临床，为PKU的早期诊断和早期治疗提供检验学依据和基础。