[发明专利]一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种运用Real-time PCR技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，并运用此技术分析衍生性商品含有的菌体数量。

背景技术

聚合酶连锁反应(英文：Polymerase chain reaction，缩写：PCR)主要是运用DNA的变性、黏合及延伸等三步骤的循环，连续扩增目标DNA片段，使极微量的DNA放大，实时定量PCR(Real-time PCR)是在PCR过程中利用荧光探针或染料，再经由光学系统达到实时侦测(Real-time)的效果。每一次PCR扩增循环后，将其生成反应产物(荧光物质)的数量记录下来，待反应全部完成之后，以扩增循环次数(cycle number)和生成产物量绘制作图，可得到一反应曲线图形，完整的呈现PCR反应中每一个扩增循环(cycle)产物的生成情形，所以称为实时定量PCR。通过分析PCR cycle与生成产物量这两个因素之间的相对关系，来进行实验结果的判读。

Real-time PCR近年被使用的频率逐渐被提高，优点包含(1).实验时间可以大幅缩短，(2).可以在计算机上实时监测实验结果，(3).鉴定的专一性、敏感度及准确度较传统PCR方式高，(4).检测过程不用进行洋菜胶体电泳分析，除了可以节省时间及洋菜胶的材料费外，也可避免多做洋菜胶体电泳分析实验所造成的污染及操作误差。相较之下，传统PCR仅能用于定性分析，至多能达到「半定量(semi-quantitative)」的程度。

近几年来，有许多文献或专利技术，运用PCR分析或定量细菌包含益生菌的数量，说明如下。

中华人民共和国发明专利申请公布号CN 101717828 A，专利名称「一种发酵乳制品中乳酸菌种类快速检验的方法」，此方法先提取发酵乳制品中乳酸菌的DNA，并将特定区域DNA进行扩增反应，此PCR产物以凝胶电泳进行分析。电泳结果与参考菌株制成的比对标准条带进行比对，确定样品中含有的菌种种类。此方法除了需要人工操作进行标准条带比对，也只能将乳酸菌菌种定性，但不能定量。

中华人民共和国发明专利申请公布号CN 103525914 A，专利名称「一种计数植物乳杆菌活菌数的方法及其引物和试剂盒」，此方法需先将样品以平板培养基培养单菌落(单个细菌形成的菌落)，并提取活菌菌落的DNA进行PCR反应。产物利用凝胶电泳鉴定。定量计数是利用平板计数法与PCR反应比值换算可能菌数。此方法除了需要先以平板培养出单菌落，且只能将乳酸菌菌种定性，但不能定量。

中华人民共和国发明专利授权公告号CN 102994644 B，专利名称「一种植物乳杆菌定量检测方法及其检验试剂盒和应用」，此方法需提取待测样品的总RNA，以紫外分光亮度计测定吸光值，计算拷贝数进行稀释，并将RNA反转录成cDNA，再进行实时定量PCR，利用具特异性植物乳杆菌引物对，以所得cDNA为模版进行荧光PCR扩增。此方法只检测样品中存活的植物乳杆菌数量。

文献「分子信标实时PCR法快速检测双歧杆菌的研究」(微生物学通报2007)，利用Real-time PCR分析并定量双歧杆菌活菌数，揭露的益生菌的菌种、引物设计，皆与本发明不同，且只能分析活菌菌数。

台湾卫福部公告的食品微生物检验方法-乳酸菌-乳酸双叉乳酸杆菌的检验，本检验方法适用范围食品中乳酸双叉乳杆菌(Bifidobacterium lactis)的菌种鉴别，但此方法无法定量乳酸菌菌数。

世界专利合作条约(PCT)WO2010151124，专利名称Selection of a nutritional composition capable of promoting health(促进健康营养的组合物的筛检)，揭露利用PCR进行益生菌菌种鉴定，此发明仅利用PCR进行乳酸菌定性，而无法定量乳酸菌菌数。