[发明专利]一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法

权利要求书

1.一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，该方法包含下列步骤：

步骤1：取一检品溶解于无菌水中，以高速离心，将菌体离下，加入无菌水稀释，作为待测菌样品；

步骤2:待测菌样品以实时定量聚合酶连锁反应搭配目标菌专一性引物组；其中该目标菌专一性引物组是以目标菌的保守基因，包含16S rDNA、23S rDNA，16S-23S rDNA的内转录区或持家基因序列片段作为扩增目标，其中该目标菌为益生菌或病原菌；

以扩增片段的熔解曲线有无专一性波峰，确定该待测菌样品是否含有非目标菌种；

步骤3:将获得的检品Ct值带入标准品制得的标准曲线的回归方程式，可以得知待测菌样品的菌体数量。

2.根据权利要求1所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述益生菌包括双歧杆菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、链球菌属。

3.根据权利要求2所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述双歧杆菌属包含婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌；其中该肠球菌属包含粪肠球菌、屎肠球菌；其中该乳酸杆菌属包含嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌；其中该链球菌属包含嗜热链球菌。

4.根据权利要求1所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述病原菌包含产气单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属。

5.根据权利要求1所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述专一性引物组是以目标菌的保守基因，包含16S rDNA、23S rDNA、16S-23S rDNA的内转录区、持家基因等序列片段作为扩增目标；其中持家基因包含dnaK、fusA、groEL、gyrB、recA、tuf。

6.根据权利要求1或5所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述专一性引物长度为16～25bp，引物组扩增的片段长度为50～150bp。

7.根据权利要求1所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述实时定量聚合酶连锁反应的循环条件为：(1)94～95℃，10分钟；(2)94～95℃，10～15秒；(3)55～60℃，60～70秒；(4)94～95℃，10～15秒；(5)55～60℃，60～70秒(6)94～95℃，10～15秒；其中设定条件(2)与(3)重复30～45个循环。

8.根据权利要求1所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述实时定量聚合酶连锁反应的循环条件为：(1)95℃，10分钟；(2)95℃，15秒；(3)57℃，60秒(4)95℃，15秒；(5)55℃，60秒(6)95℃，15秒；条件(2)～(3)重复40个循环。

9.根据权利要求1或5所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述专一性引物组序列为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2，可用以扩增副干酪乳杆菌的序列片段。

10.根据权利要求1或5所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述专一性引物组序列为SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4，可用以扩增发酵乳杆菌的序列片段。

11.根据权利要求1所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述检品包括含有益生菌的食品、医药品、洁牙产品、化工产品、饲料添加剂，该洁牙产品包含牙膏、漱口水、牙粉。

12.根据权利要求1所述的一种以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法，其特征在于，所述以分子生物学技术分析并定量益生菌和病原菌菌体数量的方法的运用于包括食品或医药品中病原菌分析、化工产品是否遭受病菌污染。