[发明专利]一种高效稳定表达抑制性抗体的CAR‑T细胞及其用途

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学和肿瘤学领域，涉及一种能高水平稳定表达抑制性抗体的CAR-T(Chimeric antigen receptor，CAR)细胞。

背景技术

针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。其中，免疫检查点(如CTLA4、PD1/PDL1)单抗治疗，通过原位激活患者残留的肿瘤特异性T细胞发挥作用，对多种恶性肿瘤的总体有效率达到30％，且许多患者一旦起效能长期存活；转基因CAR-T/TCR-T细胞治疗，是通过离体基因修饰的手段快速获得肿瘤特异性T细胞后，过继回输进行治疗发挥作用，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)一般由一个scFv(single-chain variable Fragment)单链抗体(抗体轻重链可变区经Linker连接构成，负责结合膜抗原)，通过铰链结构(负责形成正确构象，形成二聚体)与跨膜区、胞内信号结构(负责传递T细胞活化信号)连接构成。经CAR基因修饰的T细胞(CAR-T)被赋予识别肿瘤细胞膜抗原肽分子，启动杀伤或增殖的能力。由于CAR-T细胞识别的是表达在细胞膜上的抗原，而非与MHC分子结合后被递呈到细胞表面的抗原，因而可以绕过T细胞MHC限制性，避免由于肿瘤细胞下调或缺失MHC分子引起的免疫逃逸。

CAR的设计最早由以色列学者Eshhar和其同事于1989年提出，按其发展阶段到目前为止可分为三代。第一代CAR受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的svFC片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少等缺点。第二代CAR受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activation protein 10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation induced cell death,AICD)。第三代CAR受体则是在第二代CAR的基础上再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，从而产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。近年来，有部分学者提出第四代CAR受体概念，他们在第三代CAR的基础上增加了IL12、IL15等具有正向调节T细胞功能的细胞因子，进一步提高T细胞的增殖、杀伤、体内存活能力。

目前，已有多个靶标的CAR-T细胞正在开展实体瘤治疗的临床试验，包括GD2、FR-α、L1-CAM、HER2、EGFR、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、Mesothelin、c-MET、PSMA、CEA、GPC3、EphA2、MUC1、CAIX(carbonic anhydrase IX)等。其中，部分临床试验取得相对良好的结果，例如，针对GD2的CAR-T细胞治疗高风险性神经母细胞瘤的临床试验(19例患者)，8例患者回输后肿瘤完全消退，3例未消退的患者在回输后第6周的观察时间点显示完全应答，1名完全应答患者192周仍能检测到CAR-T细胞；针对HER2的CAR-T细胞治疗HER2阳性实体瘤临床试验(共19例，其中骨肉瘤16例)，4例维持无疾病进展状态12周至14月，其中3例肿瘤消退，1例消退90％以上。然而总体而言，实体瘤的CAR-T治疗相对于血液肿瘤，疗效仍存在较大差距，究其原因，主要包括：

1、抑制免疫的微环境