[发明专利]唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学检测领域，具体为唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，旨在建立一种快速、无创检测人体内AMA-M2水平的技术。

背景技术

酶联免疫吸附实验法(ELISA)是分析化学领域中较为成熟的技术之一，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种免疫测定技术。该技术采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。这种有色产物可用酶标仪加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强，敏感度高，易于推广。

PBC是一种自身免疫性肝病，主要表现为肝内小胆管的进行性破坏，最终导致肝硬化，甚至肝衰竭，严重危害人类健康。因PBC发病隐匿，疾病的早期筛查、早期发现和早期处理，对PBC的治疗和病人的预后十分重要。抗线粒体抗体(AMA)，特别是抗线粒体抗体M2型(AMA-M2)，是PBC的特异性血清学标志，其特异度和灵敏度都高达95％以上，是目前临床用于诊断PBC的重要指标。现有的血液检测技术虽十分成熟，但其自身有一定的局限性：1、首先血液的获取是一种有创的手段，样本的获取需要有专业的技术；2、血液获取过程中，受试者易产生不适感和一定感染风险；3、血液样本的获取和处理成本较高。正因为这些缺陷的存在，血液检测并不利于原发性胆汁性肝硬化的大规模筛查，寻找一种无创便捷的介质进行AMA-M2检测是十分必要的。

唾液是一种无色且稀薄的液体，唾液中含有电解质，蛋白质，酶，细胞因子等成分。唾液主要由唾液腺分泌，而外周血中的成分可以通过被动扩散，主动运输，超滤等方式进入唾液。因此，唾液可以在一定程度上反映外周血的情况，而且唾液的获取具有无创，易获得，技术要求低，成本低等诸多优势，是一种理想的血清替代品。目前，用于检测AMA-M2局限于血液途径，利用唾液进行AMA-M2检测的试剂盒和方法还没出现。本发明主要是利用改良的AMA-M2检测试剂盒进行唾液中AMA-M2检测的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒中包括下述组分：

AMA-M2标准品；

M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；

酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；

样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA-PBS溶液；

辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。

本发明中，所述样本稀释液的配制方法为：取牛血清白蛋白1g，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。

本发明中，所述底物显色液为TMB/H₂O₂，是通过下述方法配制获得：

(1)配制底物显色液A：

取四甲基联苯胺(TMB)20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、柠檬酸95mg、甘油5ml，以ddH₂O定容至50ml后混匀，避光保存；

(2)配制底物显色液B：

取醋酸钠1.36g、柠檬酸0.16g、30％过氧化氢(H₂O₂)30ul，以ddH₂O定容至50ml后混匀；

(3)使用前，将底物显色液A、B液等体积混匀，即得底物显色液TMB/H₂O₂。

本发明中，所述反应终止液为：0.5M硫酸。

本发明中，所述清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液；其配制方法为：取吐温20500ul，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。

本发明进一步提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将获取的唾液样本离心后吸取上清，用0.1％BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释；